核盘菌抗多菌灵β微管蛋白基因在禾谷镰孢菌中的表达研究
由禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）引起的小麦赤霉病是长江中下游地区威胁小麦生产和粮食安全的重要病害。多年来，以多菌灵为主的苯并咪唑类杀菌剂一直用于小麦赤霉病的化学防控，但随着药剂使用年限的增长及使用剂量的增加，病原菌已经对多菌灵产生了抗药性。前期研究表明禾谷镰孢菌存在两个β-微管蛋白基因（β1和β2），β2-微管蛋白基因点突变导致禾谷镰孢菌对多菌灵产生抗性；在核盘菌中仅存在1个β-微管蛋白基因，β-微管蛋白基因点突变导致核盘菌对多菌灵产生抗性。为进一步探明禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性机制，本文采用Double-joint PCR体外构建核盘菌抗多菌灵β-微管蛋白基因的载体，利用PEG介导的原生质体转化技术同源置换禾谷镰孢菌的β2-微管蛋白基因并获得转化子。与禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因缺失突变体相比，核盘菌抗多菌灵β-微管蛋白基因置换禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因后，菌丝生长等生物学功能得到一定程度恢复，但对多菌灵仍表现敏感。这表明，核盘菌抗多菌灵β-微管蛋白基因在禾谷镰孢菌中具有一定的生物学功能，但不能表达对多菌灵的抗药性。
目录
摘要 1
关键词 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株 2
1.1.2 培养基 3
1.1.3 CTAB法提取DNA 3
1.1.4 胶回收方法 3
1.2载体构建 3
1.2.1 扩增突变菌株JK53D5的β微管蛋白基因全序列 4
1.2.2 扩增禾谷镰孢菌菌株2021的β2微管蛋白基因上下游片段 5
1.2.3 体外构建载体 5
1.2.4 扩增载体片段 5
1.3 原生质体转化 5
1.4 突变体验证 6
1.4.1 药剂验证 6
1.4.2 PCR验证 6
1.4.3 Southern 杂交验证 6
1.5 菌落生长情况 8
1.6 突变体对多菌灵敏感性测定 9
2 结果与分析 9
2.1 载体构建的验证 9
2.2 验证结果 9< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
br /> 2.2.1 药剂验证结果 9
2.2.2 PCR 验证结果 10
2.2.3 Southern杂交验证结果 12
2.3 突变体的生长情况及对多菌灵的敏感性 13
3 讨论 14
致谢 15
参考文献......15
附录 ..17
核盘菌抗多菌灵β微管蛋白基因在禾谷镰孢菌中的表达研究
引言
引言
小麦赤霉病（Fusarium Head Blight）是由禾谷镰孢菌（Fusarinm graminearum Schw.）引起的小麦重要病害之一，又名麦穗枯、烂麦头、红麦头等等。它是小麦上的一种流行性病害，在高温、雨水充足、气候潮湿的地区最易发生[1]。小麦赤霉病是我国南方麦区的主要病害，但黄河以北地区也逐渐受其影响，每年受危害的小麦面积超过1亿亩[2]。小麦的幼苗期到抽穗期均可被小麦赤霉病所危害，主要会引起苗枯、茎基腐、穗腐、穗腐和秆腐等症状，造成小麦减产10%～20%，严重时能减产80%～90%[3]，影响小麦的产量和品质。同时，禾谷镰孢菌会产生雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol）等等毒素，这些毒素严重威胁着人类和动物的健康，可以引起人类和动物不同程度地中毒，同时还会干扰生物体内蛋白质的合成、导致免疫功能下降、腹泻、头晕、流产等等 [4]。
20世纪70年代，人类大力开发应用苯并咪唑类杀菌剂，使得化学防治在小麦病害上有了新的突破。包括多菌灵、丙硫多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、麦穗宁等在内的苯并咪唑类杀菌剂，具有广谱、内吸、高效的特点，大大地提高了防治效果，同时对用药技术和用药时间的要求也降低了，还具有保绿、抗衰老、增产等作用，对小麦相对安全。此类杀菌剂以有杀菌活性的苯并咪唑环为母体，与病原菌的β微管蛋白特异性结合，干扰病原菌微管的功能，进一步影响病原菌的细胞有丝分裂，从而达到化学防治的效果 [5]。
由于苯并咪唑类杀菌剂的作用位点单一，人们对该类杀菌剂的使用也越来越频繁，使得病原菌的抗药性问题也逐渐增多。1992年，周明国教授[6]等人在浙江海宁市的小麦病穗上检测到了世界首例禾谷镰孢菌对多菌灵有抗药性的菌株，之后的连年监测中发现，有抗性的菌株在迅速增多，同时，从地理范围来说，抗性菌株也在不断扩大。能否继续使用苯并咪唑类杀菌剂有效地防治麦类病害已成为我国化学防治路程上的一大难题，因此，对禾谷镰孢菌抗药性问题的研究迫在眉睫。根据前人的研究，我们已发现β1和β2两个微管蛋白基因同时存在于禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）中，β2微管蛋白基因第73、167、198、200位密码子的突变会导致病原菌对多菌灵产生不同水平的抗药性；而在核盘菌中仅有1个β微管蛋白，病原菌第198、200位密码子的突变会导致对多菌灵产生不同水平的抗药性。禾谷镰孢菌的β1微管蛋白基因与核盘菌的β微管蛋白基因同源性更高，但禾谷镰孢菌对多菌灵的抗性与β1微管蛋白基因无关，与β2微管蛋白基因的突变有关。为了探究其中的缘由，本实验将核盘菌抗多菌灵β微管蛋白基因同源置换禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因，探究核盘菌抗多菌灵β微管蛋白基因在禾谷镰孢菌中的表达，进一步揭示植物病原真菌β微管蛋白对多菌灵抗性的调控机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
2021，禾谷镰孢菌的野生型菌株，由本实验室保存，对多菌灵敏感。
ND23，禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因敲除突变体，用潮霉素B磷酸转移酶基因(hygromycin B phosphotransferase gene, hph)[7]单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase gene, hsv)[8]双筛标记(hphhsv)同源置换了2021 (2微管蛋白基因 [9]，本实验室保存使用，对多菌灵敏感。
JK53D5，核盘菌的突变体菌株，核盘菌β微管蛋白基因第200位氨基酸由苯丙氨酸（Phe）变为络氨酸（Tyr）的抗性菌株，本实验室保存使用，对多菌灵中抗。
1.1.2 培养基
本实验需要用到PDA培养基、YEPD培养基[10]、再生培养基[11]、覆盖培养基[12]。培养基的制备方法见附录。
1.1.3 CTAB法提取DNA
取菌丝适量于2ml的离心管中， 加入800 μl CTAB提取液，混匀，再加入一颗灭菌钢珠，在球磨仪中研磨2min；
12000 rpm条件下离心30s，取上层液400μl，加入400μl苯酚氯仿异戊醇（25:24:1）混合液抽提；
剧烈晃动后在12000 rpm条件下离心10 min，保留上清液300μl，加入750μl无水乙醇，混匀，20℃冰箱沉淀2h；
2h后，取出，12000 rpm条件下离心10 min；
倒上清液，加入75%乙醇400μl，12000 rpm条件下离心5min；
倒上清液，晾干，备用。
1.1.4 胶回收方法
在紫外灯下切目的DNA片段凝胶，放于2ml离心管中，加入适量Bingding Buffer(×P2) ，置入5560℃恒温水浴锅中至胶完全溶解，再在12000rpm条件下离心23min；
目录
摘要 1
关键词 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株 2
1.1.2 培养基 3
1.1.3 CTAB法提取DNA 3
1.1.4 胶回收方法 3
1.2载体构建 3
1.2.1 扩增突变菌株JK53D5的β微管蛋白基因全序列 4
1.2.2 扩增禾谷镰孢菌菌株2021的β2微管蛋白基因上下游片段 5
1.2.3 体外构建载体 5
1.2.4 扩增载体片段 5
1.3 原生质体转化 5
1.4 突变体验证 6
1.4.1 药剂验证 6
1.4.2 PCR验证 6
1.4.3 Southern 杂交验证 6
1.5 菌落生长情况 8
1.6 突变体对多菌灵敏感性测定 9
2 结果与分析 9
2.1 载体构建的验证 9
2.2 验证结果 9< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
br /> 2.2.1 药剂验证结果 9
2.2.2 PCR 验证结果 10
2.2.3 Southern杂交验证结果 12
2.3 突变体的生长情况及对多菌灵的敏感性 13
3 讨论 14
致谢 15
参考文献......15
附录 ..17
核盘菌抗多菌灵β微管蛋白基因在禾谷镰孢菌中的表达研究
引言
引言
小麦赤霉病（Fusarium Head Blight）是由禾谷镰孢菌（Fusarinm graminearum Schw.）引起的小麦重要病害之一，又名麦穗枯、烂麦头、红麦头等等。它是小麦上的一种流行性病害，在高温、雨水充足、气候潮湿的地区最易发生[1]。小麦赤霉病是我国南方麦区的主要病害，但黄河以北地区也逐渐受其影响，每年受危害的小麦面积超过1亿亩[2]。小麦的幼苗期到抽穗期均可被小麦赤霉病所危害，主要会引起苗枯、茎基腐、穗腐、穗腐和秆腐等症状，造成小麦减产10%～20%，严重时能减产80%～90%[3]，影响小麦的产量和品质。同时，禾谷镰孢菌会产生雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol）等等毒素，这些毒素严重威胁着人类和动物的健康，可以引起人类和动物不同程度地中毒，同时还会干扰生物体内蛋白质的合成、导致免疫功能下降、腹泻、头晕、流产等等 [4]。
20世纪70年代，人类大力开发应用苯并咪唑类杀菌剂，使得化学防治在小麦病害上有了新的突破。包括多菌灵、丙硫多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、麦穗宁等在内的苯并咪唑类杀菌剂，具有广谱、内吸、高效的特点，大大地提高了防治效果，同时对用药技术和用药时间的要求也降低了，还具有保绿、抗衰老、增产等作用，对小麦相对安全。此类杀菌剂以有杀菌活性的苯并咪唑环为母体，与病原菌的β微管蛋白特异性结合，干扰病原菌微管的功能，进一步影响病原菌的细胞有丝分裂，从而达到化学防治的效果 [5]。
由于苯并咪唑类杀菌剂的作用位点单一，人们对该类杀菌剂的使用也越来越频繁，使得病原菌的抗药性问题也逐渐增多。1992年，周明国教授[6]等人在浙江海宁市的小麦病穗上检测到了世界首例禾谷镰孢菌对多菌灵有抗药性的菌株，之后的连年监测中发现，有抗性的菌株在迅速增多，同时，从地理范围来说，抗性菌株也在不断扩大。能否继续使用苯并咪唑类杀菌剂有效地防治麦类病害已成为我国化学防治路程上的一大难题，因此，对禾谷镰孢菌抗药性问题的研究迫在眉睫。根据前人的研究，我们已发现β1和β2两个微管蛋白基因同时存在于禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）中，β2微管蛋白基因第73、167、198、200位密码子的突变会导致病原菌对多菌灵产生不同水平的抗药性；而在核盘菌中仅有1个β微管蛋白，病原菌第198、200位密码子的突变会导致对多菌灵产生不同水平的抗药性。禾谷镰孢菌的β1微管蛋白基因与核盘菌的β微管蛋白基因同源性更高，但禾谷镰孢菌对多菌灵的抗性与β1微管蛋白基因无关，与β2微管蛋白基因的突变有关。为了探究其中的缘由，本实验将核盘菌抗多菌灵β微管蛋白基因同源置换禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因，探究核盘菌抗多菌灵β微管蛋白基因在禾谷镰孢菌中的表达，进一步揭示植物病原真菌β微管蛋白对多菌灵抗性的调控机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
2021，禾谷镰孢菌的野生型菌株，由本实验室保存，对多菌灵敏感。
ND23，禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因敲除突变体，用潮霉素B磷酸转移酶基因(hygromycin B phosphotransferase gene, hph)[7]单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase gene, hsv)[8]双筛标记(hphhsv)同源置换了2021 (2微管蛋白基因 [9]，本实验室保存使用，对多菌灵敏感。
JK53D5，核盘菌的突变体菌株，核盘菌β微管蛋白基因第200位氨基酸由苯丙氨酸（Phe）变为络氨酸（Tyr）的抗性菌株，本实验室保存使用，对多菌灵中抗。
1.1.2 培养基
本实验需要用到PDA培养基、YEPD培养基[10]、再生培养基[11]、覆盖培养基[12]。培养基的制备方法见附录。
1.1.3 CTAB法提取DNA
取菌丝适量于2ml的离心管中， 加入800 μl CTAB提取液，混匀，再加入一颗灭菌钢珠，在球磨仪中研磨2min；
12000 rpm条件下离心30s，取上层液400μl，加入400μl苯酚氯仿异戊醇（25:24:1）混合液抽提；
剧烈晃动后在12000 rpm条件下离心10 min，保留上清液300μl，加入750μl无水乙醇，混匀，20℃冰箱沉淀2h；
2h后，取出，12000 rpm条件下离心10 min；
倒上清液，加入75%乙醇400μl，12000 rpm条件下离心5min；
倒上清液，晾干，备用。
1.1.4 胶回收方法
在紫外灯下切目的DNA片段凝胶，放于2ml离心管中，加入适量Bingding Buffer(×P2) ，置入5560℃恒温水浴锅中至胶完全溶解，再在12000rpm条件下离心23min；
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