一个矮杆圆粒突变体srg的遗传分析与初步定位
本实验从Dongjin为背景的T-DNA插入突变体库中挑选出粒长变短、粒宽变宽、千粒重降低等性状的矮秆圆粒突变体srg（semi-dwarf round grain），经过外源激素处理后发现突变体相对野生型对油菜素内酯(BR)表现出钝感，但在赤霉素（GA）信号途径上不存在缺陷，然后与籼稻N22构建F2群体，进行遗传分析，标记分析，基因定位研究并将其定位到第6号染色体的S6-30和RM19347之间的103kb区间内。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.2实验方法 4
1.2.1群体构建4
1.2.2农艺性状调查4
1.2. 3 外源激素处理 4
1.2.4 DNA样品制备4
1.2.5引物设计6
2结果与分析6
2. 1 DJ及突变体srg表型及农艺性状考察6
2. 2野生型和突变体srg外源激素处理7
2.2.1野生型与突变体外源BR处理7
2.2.2 野生型与突变体外源GA处理8
2.3 DJ及突变体srg的遗传9
2. 4 矮杆小粒突变体srg的基因定位9
3讨论11
参考文献12
致谢 13
一个矮秆圆粒突变体srg的遗传分析与初步定位
引言
水稻是我国人民最主要的粮食作物，常年总产量占粮食总产量的40%以上，而面积不及粮食作物面积的1/3[1]。提高水稻的产量是目前水稻育种研究的主要目标，而水稻粒形是决定水稻产量的重要因素之一。所以，阐明水稻粒形遗传调控机理，对提高水稻产量具有十分重要的意义[2]。
株高作为水稻重要的农艺性状，直接关系到水稻的产量，植株过高容易引起植株倒伏产量下降，适当矮化可达到抗倒增产的目的。第一次绿色革命，就是利用了半矮杆基因sd=1，适当降低株高，使水稻产量得到明显提高，但单一的半矮杆基因的利用易导致遗传脆弱性，因此，挖
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
掘新的矮杆基因，拓宽矮源的遗传基础，以避免目前水稻矮秆品种矮源单一的遗传特性，为水稻育种实现新的产量突破创造条件[3]，本研究即是通过筛选突变体，从矮秆圆粒材料中发掘被隐性抑制的大粒、高产的优异基因[4]。
1 材料与方法
1．1 实验材料
以Dongjin为受体，韩国An教授创制了TDNA插入突变体库，本实验室从An教授处引进了250多份突变体材料，我们根据籽粒粒型的变化，筛选出半矮秆圆粒突变体srg ，与野生型相比，突变体种子粒长显著縮短、粒宽明显增加、千粒重显著降低。但潮霉素鉴定结果表明突变体不含有潮霉素标签，说明该突变体表型与TDNA插入无关。
1．2 实验方法
1.2.1 群体构建
为鉴定Dongjin半矮秆圆粒突变性状的遗传方式，2014年在大学土桥基地对srg突变体，与亲本Dongjin的杂交，获得F1杂交种，同时利用突变体srg与籼稻品种N22杂交获得F1，之后将这两种F1杂交种在海南陵水基地自交繁殖，自交获得F2种子，2015年正季在大学土桥实验基地种植F2遗传分离群体，观察其表型并统计其分离比，同时利用获得的F2群体开展突变基因的定位研究。
农艺性状调查
2015年正季考察Dongjin与突变体srg的农艺性状。分别取成熟期的Dongjin和突变体srg各20株，测量各单株株高、穗长、各节间长度、结实率、粒长、粒宽、千粒重等各项指标。
1.2.3 外源激素处理
通过对野生型Dongjin与突变体srg农艺性状的考察，发现与野生型相比，突变体srg节间明显缩短、叶片直立、叶夹角变小、籽粒明显变小。前人研究发现大部分水稻矮杆突变体都与赤霉素（GA）或者油菜素内酯(BR)的生物合成或信号传导途径的基因突变有关[5]，我们猜测srg突变体可能与植株体内激素GA或BR相关，故对植株进行外源激素处理实验。
（1）BR处理实验
①将Dongjin及srg种子用1%次氯酸钠溶液浸种1小时，用无菌水清洗3次，然后将种子浸入水中吸胀24小时，之后再将种子置于30℃培养箱（黑暗条件下）催芽1天；
②当种子露白后转移种子到土壤中，置于30℃培养箱（16h光照、8h黑暗）中培养，并开始计时，用培养10天的幼苗进行激素处理实验。
③10天后分别剪野生型与突变体幼苗相同部位叶片，浸泡在浓度为0uM、0.1uM与1uM BR溶液中，避光处理3d后，测量叶片夹角，同时设置清水对照，每个梯度设置3个重复。
（2）GA处理实验
①将Dongjin及srg种子用1%次氯酸钠溶液浸种1小时，用无菌水清洗3次，然后将种子浸入水中吸胀24小时，之后将种子置于30℃培养箱（黑暗条件下）催芽1天；
②当种子露白后将其转移到分别含有浓度为0uM、0.01uM、0.1uM、1uM、10uM、100uM GA3的1% 琼脂培养基上，置于30℃24h光照条件下的培养箱内生长，并开始计时；
③培养10天后，测量第二叶鞘的长度，每个梯度实验设置3个重复。
1.2.4 DNA样品制备
试验采取CTAB法提取DNA：水稻叶片的DNA样品制备参照Dellaporta等[6]的方法，并作了一些改进，具体步骤如下：
1）取0.2g叶片，剪碎后放入2 ml离心管中，并放入1颗钢珠；
2）将装有叶片的离心管放入液氮中冷冻2 min；
3）用组织研磨粉碎仪将叶片研磨成粉末；
4） 事先将配好的CTAB提取液加入到65℃水浴锅中预热，向每个装有磨碎叶片的2.0ml离心管加入700ul CTAB提取液，涡旋震荡使粉末悬浮；
5）将装有样品的离心管在65 ℃水浴锅里温浴30 min，每隔10min晃动一次；
6）向装有样品的试管中加入700 μl的氯仿充分混匀后，静置10 min；
7）用低温离心机进行离心，转速为12000 rpm，离心10 min；
8）吸取上清液到1.5 ml离心管中；
9）重复第7、8步骤；
10）向装有上清液的离心管中，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，并将加入异丙醇的1.5ml离心管，放置于20℃冰箱中，静置30分钟；
11）从20℃冰箱中拿取样品，离心5分钟，倒去上清液，加入700ul 70%乙醇洗涤DNA，摇晃离心管，将DNA样品悬浮，与酒精充分接触均匀，洗涤10分钟，并重复本步骤一次。离心倒去乙醇，将离心管放置于无菌操作台上过夜，吹干乙醇；
12）每管加入400ul灭菌水溶解，置于20℃冰箱中保存；
DNA浓度及质量检测：
1) DNA浓度测定：
总DNA样品溶液用Perkin Elmer公司的MBA2000 UV/VS光谱仪进行浓度测定。
2) DNA质量检测：
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.2实验方法 4
1.2.1群体构建4
1.2.2农艺性状调查4
1.2. 3 外源激素处理 4
1.2.4 DNA样品制备4
1.2.5引物设计6
2结果与分析6
2. 1 DJ及突变体srg表型及农艺性状考察6
2. 2野生型和突变体srg外源激素处理7
2.2.1野生型与突变体外源BR处理7
2.2.2 野生型与突变体外源GA处理8
2.3 DJ及突变体srg的遗传9
2. 4 矮杆小粒突变体srg的基因定位9
3讨论11
参考文献12
致谢 13
一个矮秆圆粒突变体srg的遗传分析与初步定位
引言
水稻是我国人民最主要的粮食作物，常年总产量占粮食总产量的40%以上，而面积不及粮食作物面积的1/3[1]。提高水稻的产量是目前水稻育种研究的主要目标，而水稻粒形是决定水稻产量的重要因素之一。所以，阐明水稻粒形遗传调控机理，对提高水稻产量具有十分重要的意义[2]。
株高作为水稻重要的农艺性状，直接关系到水稻的产量，植株过高容易引起植株倒伏产量下降，适当矮化可达到抗倒增产的目的。第一次绿色革命，就是利用了半矮杆基因sd=1，适当降低株高，使水稻产量得到明显提高，但单一的半矮杆基因的利用易导致遗传脆弱性，因此，挖
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
掘新的矮杆基因，拓宽矮源的遗传基础，以避免目前水稻矮秆品种矮源单一的遗传特性，为水稻育种实现新的产量突破创造条件[3]，本研究即是通过筛选突变体，从矮秆圆粒材料中发掘被隐性抑制的大粒、高产的优异基因[4]。
1 材料与方法
1．1 实验材料
以Dongjin为受体，韩国An教授创制了TDNA插入突变体库，本实验室从An教授处引进了250多份突变体材料，我们根据籽粒粒型的变化，筛选出半矮秆圆粒突变体srg ，与野生型相比，突变体种子粒长显著縮短、粒宽明显增加、千粒重显著降低。但潮霉素鉴定结果表明突变体不含有潮霉素标签，说明该突变体表型与TDNA插入无关。
1．2 实验方法
1.2.1 群体构建
为鉴定Dongjin半矮秆圆粒突变性状的遗传方式，2014年在大学土桥基地对srg突变体，与亲本Dongjin的杂交，获得F1杂交种，同时利用突变体srg与籼稻品种N22杂交获得F1，之后将这两种F1杂交种在海南陵水基地自交繁殖，自交获得F2种子，2015年正季在大学土桥实验基地种植F2遗传分离群体，观察其表型并统计其分离比，同时利用获得的F2群体开展突变基因的定位研究。
农艺性状调查
2015年正季考察Dongjin与突变体srg的农艺性状。分别取成熟期的Dongjin和突变体srg各20株，测量各单株株高、穗长、各节间长度、结实率、粒长、粒宽、千粒重等各项指标。
1.2.3 外源激素处理
通过对野生型Dongjin与突变体srg农艺性状的考察，发现与野生型相比，突变体srg节间明显缩短、叶片直立、叶夹角变小、籽粒明显变小。前人研究发现大部分水稻矮杆突变体都与赤霉素（GA）或者油菜素内酯(BR)的生物合成或信号传导途径的基因突变有关[5]，我们猜测srg突变体可能与植株体内激素GA或BR相关，故对植株进行外源激素处理实验。
（1）BR处理实验
①将Dongjin及srg种子用1%次氯酸钠溶液浸种1小时，用无菌水清洗3次，然后将种子浸入水中吸胀24小时，之后再将种子置于30℃培养箱（黑暗条件下）催芽1天；
②当种子露白后转移种子到土壤中，置于30℃培养箱（16h光照、8h黑暗）中培养，并开始计时，用培养10天的幼苗进行激素处理实验。
③10天后分别剪野生型与突变体幼苗相同部位叶片，浸泡在浓度为0uM、0.1uM与1uM BR溶液中，避光处理3d后，测量叶片夹角，同时设置清水对照，每个梯度设置3个重复。
（2）GA处理实验
①将Dongjin及srg种子用1%次氯酸钠溶液浸种1小时，用无菌水清洗3次，然后将种子浸入水中吸胀24小时，之后将种子置于30℃培养箱（黑暗条件下）催芽1天；
②当种子露白后将其转移到分别含有浓度为0uM、0.01uM、0.1uM、1uM、10uM、100uM GA3的1% 琼脂培养基上，置于30℃24h光照条件下的培养箱内生长，并开始计时；
③培养10天后，测量第二叶鞘的长度，每个梯度实验设置3个重复。
1.2.4 DNA样品制备
试验采取CTAB法提取DNA：水稻叶片的DNA样品制备参照Dellaporta等[6]的方法，并作了一些改进，具体步骤如下：
1）取0.2g叶片，剪碎后放入2 ml离心管中，并放入1颗钢珠；
2）将装有叶片的离心管放入液氮中冷冻2 min；
3）用组织研磨粉碎仪将叶片研磨成粉末；
4） 事先将配好的CTAB提取液加入到65℃水浴锅中预热，向每个装有磨碎叶片的2.0ml离心管加入700ul CTAB提取液，涡旋震荡使粉末悬浮；
5）将装有样品的离心管在65 ℃水浴锅里温浴30 min，每隔10min晃动一次；
6）向装有样品的试管中加入700 μl的氯仿充分混匀后，静置10 min；
7）用低温离心机进行离心，转速为12000 rpm，离心10 min；
8）吸取上清液到1.5 ml离心管中；
9）重复第7、8步骤；
10）向装有上清液的离心管中，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，并将加入异丙醇的1.5ml离心管，放置于20℃冰箱中，静置30分钟；
11）从20℃冰箱中拿取样品，离心5分钟，倒去上清液，加入700ul 70%乙醇洗涤DNA，摇晃离心管，将DNA样品悬浮，与酒精充分接触均匀，洗涤10分钟，并重复本步骤一次。离心倒去乙醇，将离心管放置于无菌操作台上过夜，吹干乙醇；
12）每管加入400ul灭菌水溶解，置于20℃冰箱中保存；
DNA浓度及质量检测：
1) DNA浓度测定：
总DNA样品溶液用Perkin Elmer公司的MBA2000 UV/VS光谱仪进行浓度测定。
2) DNA质量检测：
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/451.html
