水通道蛋白pip1;4参与水分运输的研究
大部分研究认为拟南芥的PIP（plasmabrane intrinsic protein）2家族对于水分的运输起着重要的作用，PIP1家族被认为参与其他的一些生理生化过程，但我们的研究表明AtPIP1;4参与了水分跨膜的运输。我们成功构建了爪蟾卵母细胞表达体系，并通过这个体系成功表达了AtPIP1;4和eGFP的融合蛋白，在荧光显微镜下，我们观察到了AtPIP1;4的表达情况以及亚细胞定位情况，AtPIP1;4存在于细胞质和细胞膜上。显微观察发现，转化了AtPIP1;4蛋白的爪蟾卵母细胞比对照的导水率有着显著性地提高，这表明AtPIP1;4对水分跨膜运输有一定作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1菌株、质粒和爪蟾3
1.1.2引物4
1.1.3培养基4
1.1.4抗生素、酶4
1.2方法 4
1.2.1拟南芥RNA提取及反转录4
1.2.2 AtPIP1;4基因的克隆6
1.2.3 pGH19AtPIP1;4eGFP和pGH19eGFP载体的构建6
1.2.4 AtPIP1;4eGFP和eGFP的cRNA获取方法9
1.2.5 AtPIP1;4eGFP和eGFP的功能研究10
2结果与分析11
2.1构建pGH19AtPIP1;4eGFP和pGH19eGFP 11
2.1.1成功克隆到AtPIP1;4基因11
2.1.2成功构建pGH19AtPIP1;4eGFP和pGH19eGFP载体12
2.2 AtPIP1;4在爪蟾卵母细胞中的表达及功能分析 12
3讨论 13
致谢13
参考文献13
水通道蛋白PIP1;4参与水分运输的研究
引言
引言：水通道蛋白是一类小分子膜内在蛋白,属于膜上的主体内在蛋白家族(MIPs)。1992年CHIP28的水通道功能通过爪蟾卵母细胞表达系统得到了证实 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
,并于1997年由基因组命名 委员会命名为Aquaporin。1993年Maurel等[1]从拟南芥中分离鉴定了第一个植物水通道蛋白基因γTIP,这是一种液泡膜内在蛋白(TIPs) ,它的水分转运功能同样通过爪蟾卵母细胞表达系统得到了验证,为水通道蛋白在植物中水分转运以及渗透势调节的机理研究提供了重要的科学依据。至今已在一系列物种中发现了越来越多的水通道蛋白。例如,在玉米[2]、拟南芥[3]、水稻[4]和棉花[5]中分别发现了36、35、33、71种水通道蛋白。根据序列的同源性又可将植物中的水通道蛋白分成四类,其中质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsicprotein,PIP)和液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsicprotein,TIP)在植物中的分布最为广泛[6]。此外,在大豆的固氮共生根瘤的类囊体膜上存在大量的结瘤素26(GmNOD26)内在蛋白,因此该类水通道蛋白被命名为类NOD26内在蛋白(NIPs)。NIPs同样存在于非豆科类植物中,如拟南芥中存在9种NIPs[5]。第四类是小分子碱性内在蛋白(SIPs)。在植物中,这四类AQPs是高度保守的,不同物种之间的同源水通道蛋白也很难区分[4]。此外,在某些植物中又发现了一些新的水通道蛋白类型,苔藓(Physcomitrella patens)通过水平基因转移能够表达一种细菌甘油转运蛋白GlpF的同系物[6],这样苔藓和一些其他植物(如白杨)就能够编码第五类水通道蛋白,这种新的AQPs与PIPs相近但又明显不同[5]。
最初对水通道蛋白的认识主要集中在它们所具有的水通道活性,近来的研究发现,水通道蛋白也参与了某些生理过程中一些其他底物的跨膜转运[6]。盐害、干旱和低温等各种非生物胁迫因素严重影响植物的生长,植物主要通过水和多种溶质的转运和区室化等一系列方式来维持体内渗透平衡和离子平衡,降低所受到的伤害[7]。在水和溶质的转运和区室化过程中,水和一些中性分子(尿素、硼酸、硅酸等)的跨膜转运主要是通过水通道蛋白(AQPs)来完成的[7]。因此,植物水通道蛋白的发现对于研究植物中水分和一些其他中性分子的吸收以及细胞与组织间的跨膜转运具有重要的意义,同时也为植物抗逆的研究开辟了新的领域。
植物的绝大部分组织中都存在水通道蛋白,并且不同类型的水通道蛋白在植物发育中的不同阶段具有其各自独特的功能,因此,不同的水通道蛋白基因的表达在不同生长发育阶段都受到了严谨的调控。通过调节水通道蛋白编码基因的转录,或者改变AQPs蛋白合成的速度可以调控水通道蛋白在植物细胞中的含量。植物的生长发育阶段、植物激素水平和各种生长环境变化等都会影响AQPs基因的转录水平,与共翻译及翻译后调控相比,这种调节方式响应速度较慢。有研究表明,细胞的动态分区和膜的循环可能也参与了水分渗透的调节[8]。植物激素如脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、油菜素内酯(BR)和乙烯(C2H4)等都能够调控植物AQPs基因的表达[9]。在植物中,ABA是一种非常 重要的调控信号分子,主要参与响应干旱和盐胁迫[10]。植物在缺水的情况下会大量积累ABA,同时激活多种ABA应答基因的表达,ABA的刺激会增加植物根系细胞和组织水平上的水导度,影响气孔的开闭,如拟南芥的PIP1b基因表达受到ABA和GA3的诱导,γTIP的表达受到GA3的诱导,这表明植物中ABA诱导AQPs基因的表达,改变了植物膜的透水性。环境胁迫同样会影响AQPs基因的表达,水通道蛋白家族基因的表达调控在植物适应不同环境条件过程中也非常重要。豌豆的7a基因是第一个被确认的受到水胁迫诱导表达的AQPs基因,它属于PIP1亚家族[12]。研究发现在高浓度盐胁迫时会造成短时间内多个水通道蛋白基因的表达水平显著降低,然而随着细胞内渗透调节物质的积累,AQPs基因的表达能够逐渐恢复到胁迫前的水平甚至更高,这表明AQPs基因的表达受到动态的调控以适应不同的环境变化。
近年来蛋白组学和质谱技术的发展使得人们可以更为全面的了解水通道蛋白的共翻译和翻译后的修饰。虽然大部分的AQPs不会受到糖基化的调控,但是Miao等[11]发现了大豆GmNOD26和冰叶日中花McTIP的糖基化现象,同时Vera Estrella等人也证明了糖基化是环境胁迫所造成的水通道蛋白移位所必需的。水通道蛋白还是植物膜上第一个被发现能被甲基化的蛋白质,例如,拟南芥的AtPIP2;1的Lys3残基能够携带1个甲基化基团, Glu6残基能够携带2个甲基化基团。这些结果表明,除了种类的多样性,植物水通道蛋白还会通过多种多样的修饰对其活性进行复杂的共翻译和翻译后调控。研究发现PIP1类质膜内在蛋白在爪蟾卵母细胞表达系统中并不具有通道活性,这是因为在爪蟾卵母细胞中单独表达的PIP1s并不能正确的转运到质膜上,然而玉米的 PIP1s与少量PIP2在爪蟾卵母细胞中共表达的时候就能够表现出正常的水通道蛋白的功能,进一步的亲和共纯化、免疫共纯化以及在共表达PIP1s和PIP2s的玉米原生质体中进行的荧光共振能量转移成像(FRET)研究表明,在植物细胞和爪蟾卵母细胞中,两类质膜内在蛋白PIP1s和PIP2s能够直接互作形成异源四聚体, 促进PIP1s在植物细胞中从内质网向质膜的转移[12]。Temmei等[13]发现PIP1类水通道蛋白的磷酸化也与其向内质网转移的过程有关,含羞草PIP1环B的磷酸化在与其他水通道蛋白的互作中并不是必需的,但是在爪蟾卵母细胞中环B的磷酸 化能够整体的提高PIP1PIP2复合物的水分转运效率。PIP1和PIP2的这种互作依赖的转移过程就包含了广泛的不同水通道蛋白间互相组合调控的可能性,这种异源四聚体与PIP1s和PIP2s各自形成的同源四聚体在功能方面的差异目前仍不明确。同其他的膜蛋白相似,PIP2类水通道蛋白在质膜上也是不停循环的,网格蛋白能够诱导质膜PIP2通过内陷进入胞内[14],而生长素能够抑制这一过程[15]。水通道蛋白的门控机制即孔道的打开和关闭受到多种因素的调节。在爪蟾卵母细胞功能性表达野生型、磷酸化位点发生突变的PvTIP3;1、GmNOD26和SoPIP2;1以及外源性蛋白激酶和磷酸酶所导致的水通道蛋白的通道活性变化均表明,AQPs的磷酸化对于其门控机制是非常重要的[16]。在纯化的类菌体周膜上所进行的停流检测发现,碱性磷酸酶导致GmNOD26去磷酸化而显著地降低其对水的通透性,说明了磷酸化在GmNOD26门控调节中发挥作用[16]。Gerbeau等[17]分别通过在拟南芥悬浮培养细胞和甜菜的根中纯化得到的质膜囊泡进行水分转运实验,结果表明胞质侧的质子和二价阳离子同样会调节PIPs的通透性。爪蟾卵母细胞中的水通道蛋白结构功能分析及所得到的菠菜SoPIP2;1呈现打开和闭合构象时的原子结构特征 阐明了水通道蛋白门控的分子机理[18]。PIPs环D上高度保守的组氨酸残基都能够结合胞质侧的质 子,质子化或是结合二价阳离子的 His 残基能够引 起环 D 的构象发生改变从而关闭水通道蛋白的孔道[19]。菠菜SoPIP2;1的原子结构模型表明了环 B 的磷酸化能够开启环D,使AQPs孔道打开,同时C末端的磷酸化反而会阻止相邻AQPs单体的环D变为孔道关闭的构象[20]。Ye等[21]通过对轮藻细胞进行压力检测发现当在膜的两侧同时存在某些溶质时,就会影响水通道蛋白的门控调节过程,使细胞膜对水的通透性受到抑制,并且这种抑制作用与溶质的分子大小是密切相关的,因此,Ye等[20]提出了水通道蛋白的紧张/松弛模型:有些溶质会阻塞在孔道的一端,AQPs排斥这些溶质的时候会产生渗透压力而转变为紧张状态,这会进一步造成孔道的关闭。羟基自由基同样会显著并且可逆地(90%以上)抑制轮藻细胞的水分转运,这是由水通道蛋白的氧化所造成的,然而,由活性氧所造成的拟南芥根中水通道蛋白的抑制作用却与细胞中信号传导相关的[22]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1菌株、质粒和爪蟾3
1.1.2引物4
1.1.3培养基4
1.1.4抗生素、酶4
1.2方法 4
1.2.1拟南芥RNA提取及反转录4
1.2.2 AtPIP1;4基因的克隆6
1.2.3 pGH19AtPIP1;4eGFP和pGH19eGFP载体的构建6
1.2.4 AtPIP1;4eGFP和eGFP的cRNA获取方法9
1.2.5 AtPIP1;4eGFP和eGFP的功能研究10
2结果与分析11
2.1构建pGH19AtPIP1;4eGFP和pGH19eGFP 11
2.1.1成功克隆到AtPIP1;4基因11
2.1.2成功构建pGH19AtPIP1;4eGFP和pGH19eGFP载体12
2.2 AtPIP1;4在爪蟾卵母细胞中的表达及功能分析 12
3讨论 13
致谢13
参考文献13
水通道蛋白PIP1;4参与水分运输的研究
引言
引言：水通道蛋白是一类小分子膜内在蛋白,属于膜上的主体内在蛋白家族(MIPs)。1992年CHIP28的水通道功能通过爪蟾卵母细胞表达系统得到了证实 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
,并于1997年由基因组命名 委员会命名为Aquaporin。1993年Maurel等[1]从拟南芥中分离鉴定了第一个植物水通道蛋白基因γTIP,这是一种液泡膜内在蛋白(TIPs) ,它的水分转运功能同样通过爪蟾卵母细胞表达系统得到了验证,为水通道蛋白在植物中水分转运以及渗透势调节的机理研究提供了重要的科学依据。至今已在一系列物种中发现了越来越多的水通道蛋白。例如,在玉米[2]、拟南芥[3]、水稻[4]和棉花[5]中分别发现了36、35、33、71种水通道蛋白。根据序列的同源性又可将植物中的水通道蛋白分成四类,其中质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsicprotein,PIP)和液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsicprotein,TIP)在植物中的分布最为广泛[6]。此外,在大豆的固氮共生根瘤的类囊体膜上存在大量的结瘤素26(GmNOD26)内在蛋白,因此该类水通道蛋白被命名为类NOD26内在蛋白(NIPs)。NIPs同样存在于非豆科类植物中,如拟南芥中存在9种NIPs[5]。第四类是小分子碱性内在蛋白(SIPs)。在植物中,这四类AQPs是高度保守的,不同物种之间的同源水通道蛋白也很难区分[4]。此外,在某些植物中又发现了一些新的水通道蛋白类型,苔藓(Physcomitrella patens)通过水平基因转移能够表达一种细菌甘油转运蛋白GlpF的同系物[6],这样苔藓和一些其他植物(如白杨)就能够编码第五类水通道蛋白,这种新的AQPs与PIPs相近但又明显不同[5]。
最初对水通道蛋白的认识主要集中在它们所具有的水通道活性,近来的研究发现,水通道蛋白也参与了某些生理过程中一些其他底物的跨膜转运[6]。盐害、干旱和低温等各种非生物胁迫因素严重影响植物的生长,植物主要通过水和多种溶质的转运和区室化等一系列方式来维持体内渗透平衡和离子平衡,降低所受到的伤害[7]。在水和溶质的转运和区室化过程中,水和一些中性分子(尿素、硼酸、硅酸等)的跨膜转运主要是通过水通道蛋白(AQPs)来完成的[7]。因此,植物水通道蛋白的发现对于研究植物中水分和一些其他中性分子的吸收以及细胞与组织间的跨膜转运具有重要的意义,同时也为植物抗逆的研究开辟了新的领域。
植物的绝大部分组织中都存在水通道蛋白,并且不同类型的水通道蛋白在植物发育中的不同阶段具有其各自独特的功能,因此,不同的水通道蛋白基因的表达在不同生长发育阶段都受到了严谨的调控。通过调节水通道蛋白编码基因的转录,或者改变AQPs蛋白合成的速度可以调控水通道蛋白在植物细胞中的含量。植物的生长发育阶段、植物激素水平和各种生长环境变化等都会影响AQPs基因的转录水平,与共翻译及翻译后调控相比,这种调节方式响应速度较慢。有研究表明,细胞的动态分区和膜的循环可能也参与了水分渗透的调节[8]。植物激素如脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、油菜素内酯(BR)和乙烯(C2H4)等都能够调控植物AQPs基因的表达[9]。在植物中,ABA是一种非常 重要的调控信号分子,主要参与响应干旱和盐胁迫[10]。植物在缺水的情况下会大量积累ABA,同时激活多种ABA应答基因的表达,ABA的刺激会增加植物根系细胞和组织水平上的水导度,影响气孔的开闭,如拟南芥的PIP1b基因表达受到ABA和GA3的诱导,γTIP的表达受到GA3的诱导,这表明植物中ABA诱导AQPs基因的表达,改变了植物膜的透水性。环境胁迫同样会影响AQPs基因的表达,水通道蛋白家族基因的表达调控在植物适应不同环境条件过程中也非常重要。豌豆的7a基因是第一个被确认的受到水胁迫诱导表达的AQPs基因,它属于PIP1亚家族[12]。研究发现在高浓度盐胁迫时会造成短时间内多个水通道蛋白基因的表达水平显著降低,然而随着细胞内渗透调节物质的积累,AQPs基因的表达能够逐渐恢复到胁迫前的水平甚至更高,这表明AQPs基因的表达受到动态的调控以适应不同的环境变化。
近年来蛋白组学和质谱技术的发展使得人们可以更为全面的了解水通道蛋白的共翻译和翻译后的修饰。虽然大部分的AQPs不会受到糖基化的调控,但是Miao等[11]发现了大豆GmNOD26和冰叶日中花McTIP的糖基化现象,同时Vera Estrella等人也证明了糖基化是环境胁迫所造成的水通道蛋白移位所必需的。水通道蛋白还是植物膜上第一个被发现能被甲基化的蛋白质,例如,拟南芥的AtPIP2;1的Lys3残基能够携带1个甲基化基团, Glu6残基能够携带2个甲基化基团。这些结果表明,除了种类的多样性,植物水通道蛋白还会通过多种多样的修饰对其活性进行复杂的共翻译和翻译后调控。研究发现PIP1类质膜内在蛋白在爪蟾卵母细胞表达系统中并不具有通道活性,这是因为在爪蟾卵母细胞中单独表达的PIP1s并不能正确的转运到质膜上,然而玉米的 PIP1s与少量PIP2在爪蟾卵母细胞中共表达的时候就能够表现出正常的水通道蛋白的功能,进一步的亲和共纯化、免疫共纯化以及在共表达PIP1s和PIP2s的玉米原生质体中进行的荧光共振能量转移成像(FRET)研究表明,在植物细胞和爪蟾卵母细胞中,两类质膜内在蛋白PIP1s和PIP2s能够直接互作形成异源四聚体, 促进PIP1s在植物细胞中从内质网向质膜的转移[12]。Temmei等[13]发现PIP1类水通道蛋白的磷酸化也与其向内质网转移的过程有关,含羞草PIP1环B的磷酸化在与其他水通道蛋白的互作中并不是必需的,但是在爪蟾卵母细胞中环B的磷酸 化能够整体的提高PIP1PIP2复合物的水分转运效率。PIP1和PIP2的这种互作依赖的转移过程就包含了广泛的不同水通道蛋白间互相组合调控的可能性,这种异源四聚体与PIP1s和PIP2s各自形成的同源四聚体在功能方面的差异目前仍不明确。同其他的膜蛋白相似,PIP2类水通道蛋白在质膜上也是不停循环的,网格蛋白能够诱导质膜PIP2通过内陷进入胞内[14],而生长素能够抑制这一过程[15]。水通道蛋白的门控机制即孔道的打开和关闭受到多种因素的调节。在爪蟾卵母细胞功能性表达野生型、磷酸化位点发生突变的PvTIP3;1、GmNOD26和SoPIP2;1以及外源性蛋白激酶和磷酸酶所导致的水通道蛋白的通道活性变化均表明,AQPs的磷酸化对于其门控机制是非常重要的[16]。在纯化的类菌体周膜上所进行的停流检测发现,碱性磷酸酶导致GmNOD26去磷酸化而显著地降低其对水的通透性,说明了磷酸化在GmNOD26门控调节中发挥作用[16]。Gerbeau等[17]分别通过在拟南芥悬浮培养细胞和甜菜的根中纯化得到的质膜囊泡进行水分转运实验,结果表明胞质侧的质子和二价阳离子同样会调节PIPs的通透性。爪蟾卵母细胞中的水通道蛋白结构功能分析及所得到的菠菜SoPIP2;1呈现打开和闭合构象时的原子结构特征 阐明了水通道蛋白门控的分子机理[18]。PIPs环D上高度保守的组氨酸残基都能够结合胞质侧的质 子,质子化或是结合二价阳离子的 His 残基能够引 起环 D 的构象发生改变从而关闭水通道蛋白的孔道[19]。菠菜SoPIP2;1的原子结构模型表明了环 B 的磷酸化能够开启环D,使AQPs孔道打开,同时C末端的磷酸化反而会阻止相邻AQPs单体的环D变为孔道关闭的构象[20]。Ye等[21]通过对轮藻细胞进行压力检测发现当在膜的两侧同时存在某些溶质时,就会影响水通道蛋白的门控调节过程,使细胞膜对水的通透性受到抑制,并且这种抑制作用与溶质的分子大小是密切相关的,因此,Ye等[20]提出了水通道蛋白的紧张/松弛模型:有些溶质会阻塞在孔道的一端,AQPs排斥这些溶质的时候会产生渗透压力而转变为紧张状态,这会进一步造成孔道的关闭。羟基自由基同样会显著并且可逆地(90%以上)抑制轮藻细胞的水分转运,这是由水通道蛋白的氧化所造成的,然而,由活性氧所造成的拟南芥根中水通道蛋白的抑制作用却与细胞中信号传导相关的[22]。
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