二点委夜蛾的微卫星开发
二点委夜蛾是我国新发现的一种危害性极强的害虫。由于它是我国近几年发生的害虫，其相关的报道较少，所以目前对二点委夜蛾的突发是由于外地虫源迁入还是本地虫源种群扩张造成尚未可知。通过研究二点委夜蛾的种群遗传结构可以揭示二点委夜蛾暴发的原因，而目前对二点委夜蛾种群遗传结构的分子标记研究相对滞后，现今研究所采用的手段仅有微卫星间隔序列标记和线粒体COI标记，这两种标记无法辨别物种是纯合子还是杂合子，多态性相对较低且稳定性较差，而微卫星分子标记兼具共显性遗传、多态性好且稳定的特性，为种群遗传研究的理想标记。因此本文在目前研究的基础上，利用利用EST（expressed sequence tag，表达序列标签）数据库开发了13对新的微卫星位点，在开发的13个微卫星位点中，其中11个位点扩增条带清晰且多态性良好。每个位点具有2～13个等位基因，一共86个等位基因，平均每个位点有6.6个等位基因，为后续的二点委夜蛾种群遗传研究的提供参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法4
1.1实验材料与仪器设备4
1.1.1实验材料4
1.1.2实验仪器5
1.2数据处理与实验方法5
1.2.1开发流程 5
1.2.2 DNA提取6
1.2.3二点委夜蛾EST序列的下载与分析6
1.2.4微卫星引物筛选6
2结果与分析8
2.1引物筛选结果8
2.2微卫星开发结果8
2.3结果分析9
3讨论10
致谢10
参考文献10
附录 13
二点委夜蛾的微卫星开发
引言
引言
遗传标记在遗传学的建立和发展过程中有着举足轻重的作用。目前，应用较为广泛的遗传标记有形态标记（morphological markers）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（biochemical markers）和分子标记（molecular markers）。前三种遗传标记都是基 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
因表达的结果为基础的, 是对基因的间接反映，而分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。一般来说，相较于形态标记和生化标记，分子标记具有许多独特的优点[12]：①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译),而不改变基因结构即DNA的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型,提供完整的遗传信息。⑥DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。通过检测手段和相关技术，王军等[3]将分子标记分为三代四类。（1）第一代分子标记。限制性片段长度多态性技术(RFLP)最早由Grodzicker于1974年创立，于1980年被Bostein再次提出[4]。RFLP技术首先被作为遗传标记使用,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段。其基本原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此，凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变和一段DNA的重新组织如缺失、插入、倒位和易位造成酶切位点间的长度发生变化等均可导致RFLP的产生。RFLP标记具有很高的分辨力,又以共显性的方式遗传，其结果稳定可靠，准确性高，重复性好，特别适应于构建遗传连锁图。当然，RFLP技术也有不足处。在进行RFLP分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。并且RFLP技术对DNA需要量大，实验周期长，成本高。（2）第二代分子标记。第二代分子标记技术大致可以分为两类，一类是基于PCR的分子标记，如随机扩增多态DNA技术(RAPD)和简单序列长度多态性标记(SSR),也称微卫星。为了克服RFLP技术上的缺点,Williams等[5]于1990年建立了RAPD技术,由于其独特的检测DNA多态性的方式使得RAPD技术很快成为基因研究领域广泛使用的标记手段。与RFLP不同的是，其显示多态性的片段不是由限制性内切酶酶切基因组DNA产生的,而是通过PCR反应扩增基因组DNA的模板产生的；SSR分子标记由Litt M[6]等于1989年创建的。广泛存在于真核生物基因组中当中，由16个核苷酸串联重复而形成的核苷酸序列，由于重复次数的不同及重复程度的不同造成了每个位点的多态性。SSR标记具有以孟德尔方式分离、呈共显性遗传等优点。另一类是基于PCR与限制性内切酶技术结合的分子标记，如 扩增片段长度多态技术(AFLP)。1993年荷兰KEYGENE公司的Zabean和Vos等[7]发明了AFLP技术，并已申请专利。AFLP技术基本原理是将DNA用限制性内切酶酶切后产生的片段，用特定接头(与酶切位点互补)连接起来,并通过5端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段[8]。AFLP集RFLP与RAPD两种分子标记技术的优势于一体，重复性好，稳定性高，只需要极少的DNA样品。但实验的过程较为复杂，,涉及到DNA限制性内切酶的酶切、接头的连接、PCR扩增及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析等诸多步骤，无论哪个环节出现问题都无法得到理想的结果。（3）第三代分子标记。第三代分子标记是基于单核苷酸多态性(SNP)的DNA分子标记。它是继RFLP、SSR之后的又一种新的分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入[9]。SNP几乎存在于所有生物的基因组中，并且具有高度遗传稳定性易于自动化分析。EST标记技术，中文译为表达序列标签，EST的出现是开发微卫星标记的一个重要资源。EST是一段短的cDNA序列,大约200700bp。EST可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因,所以被称之为“表达序列标签”。
目前，微卫星标记已广泛应用于动植物的相关研究中，近年来，微卫星标记在昆虫学研究中的应用取得了长足进展，极大的促进了昆虫学研究的发展。（1）微卫星标记在昆虫地理种群上的应用。Caldera等[10]应用微卫星标记和线粒体DNA研究入侵美国的红火蚁Solenopsis invicta时，发现了入侵种群来自于特定地理种群的现象；Chu等[11]通过比较线粒体DNA单倍型与微卫星等位基因发现，我国山东省Q型烟粉虱的来源种群具有地理偏倚性，而同样具有较高遗传多样性的东地中海Q型烟粉虱种群则没有传入山东省。（2）微卫星标记在昆虫入侵上的应用。在研究某些入侵昆虫时，微卫星标记比线粒体 DNA 标记更为有效，其中的关键是筛选出多态性高的微卫星位点[1213]。Tsutsui等应用微卫星标记和线粒体DNA研究阿根廷蚂蚁Linepithema humile的种群起源问题。根据历史记载，阿根廷蚂蚁于1913 年从阿根廷和巴西入侵北美大陆，但由于线粒体DNA多态性很低，未能获得入侵来源的信息。然而，多态性高的微卫星标记可以分析出北美大陆的阿根廷蚂蚁起源于阿根廷Pio Parama地区。（3）微卫星标记在昆虫迁飞习性上的应用。Guo 等[14]通过5个微卫星分子标记研究了我国麦长管蚜的15个地理种群遗传结构，发现东部平原各种群间的遗传距离较近，西部高原各种群间的遗传距离较远。推测在地理距离相当的情况下，地势可以阻碍迁飞但总趋势是遗传距离随地理距离的增大而增大的。（4）微卫星标记在昆虫行为和习性上的应用。Tronttietal[15]利用微卫星标记研究了斜结蚁3个种群的分布模式和交配行为；Kraaijeveldetal[16]利用微卫星分析地中海野生雌性果蝇的后代,发现在繁殖季节,雌性果蝇交尾的频率高是普遍现象,该研究结果为利用不育技术防治害虫奠定了一定的基础。（5）微卫星标记在昆虫种群遗传结构上的应用。龚鹏等通过微卫星引物PCR扩增方法,对不同季节上的棉蚜、不同寄主的棉蚜及不同蚜型的种群分化进行了DNA多态性研究。发现冬寄主上棉蚜种群分化较小,而冬寄主种群和夏寄主种群之间棉蚜有较大的遗传分化[1718]。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法4
1.1实验材料与仪器设备4
1.1.1实验材料4
1.1.2实验仪器5
1.2数据处理与实验方法5
1.2.1开发流程 5
1.2.2 DNA提取6
1.2.3二点委夜蛾EST序列的下载与分析6
1.2.4微卫星引物筛选6
2结果与分析8
2.1引物筛选结果8
2.2微卫星开发结果8
2.3结果分析9
3讨论10
致谢10
参考文献10
附录 13
二点委夜蛾的微卫星开发
引言
引言
遗传标记在遗传学的建立和发展过程中有着举足轻重的作用。目前，应用较为广泛的遗传标记有形态标记（morphological markers）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（biochemical markers）和分子标记（molecular markers）。前三种遗传标记都是基 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
因表达的结果为基础的, 是对基因的间接反映，而分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。一般来说，相较于形态标记和生化标记，分子标记具有许多独特的优点[12]：①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译),而不改变基因结构即DNA的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型,提供完整的遗传信息。⑥DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。通过检测手段和相关技术，王军等[3]将分子标记分为三代四类。（1）第一代分子标记。限制性片段长度多态性技术(RFLP)最早由Grodzicker于1974年创立，于1980年被Bostein再次提出[4]。RFLP技术首先被作为遗传标记使用,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段。其基本原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此，凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变和一段DNA的重新组织如缺失、插入、倒位和易位造成酶切位点间的长度发生变化等均可导致RFLP的产生。RFLP标记具有很高的分辨力,又以共显性的方式遗传，其结果稳定可靠，准确性高，重复性好，特别适应于构建遗传连锁图。当然，RFLP技术也有不足处。在进行RFLP分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。并且RFLP技术对DNA需要量大，实验周期长，成本高。（2）第二代分子标记。第二代分子标记技术大致可以分为两类，一类是基于PCR的分子标记，如随机扩增多态DNA技术(RAPD)和简单序列长度多态性标记(SSR),也称微卫星。为了克服RFLP技术上的缺点,Williams等[5]于1990年建立了RAPD技术,由于其独特的检测DNA多态性的方式使得RAPD技术很快成为基因研究领域广泛使用的标记手段。与RFLP不同的是，其显示多态性的片段不是由限制性内切酶酶切基因组DNA产生的,而是通过PCR反应扩增基因组DNA的模板产生的；SSR分子标记由Litt M[6]等于1989年创建的。广泛存在于真核生物基因组中当中，由16个核苷酸串联重复而形成的核苷酸序列，由于重复次数的不同及重复程度的不同造成了每个位点的多态性。SSR标记具有以孟德尔方式分离、呈共显性遗传等优点。另一类是基于PCR与限制性内切酶技术结合的分子标记，如 扩增片段长度多态技术(AFLP)。1993年荷兰KEYGENE公司的Zabean和Vos等[7]发明了AFLP技术，并已申请专利。AFLP技术基本原理是将DNA用限制性内切酶酶切后产生的片段，用特定接头(与酶切位点互补)连接起来,并通过5端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段[8]。AFLP集RFLP与RAPD两种分子标记技术的优势于一体，重复性好，稳定性高，只需要极少的DNA样品。但实验的过程较为复杂，,涉及到DNA限制性内切酶的酶切、接头的连接、PCR扩增及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析等诸多步骤，无论哪个环节出现问题都无法得到理想的结果。（3）第三代分子标记。第三代分子标记是基于单核苷酸多态性(SNP)的DNA分子标记。它是继RFLP、SSR之后的又一种新的分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入[9]。SNP几乎存在于所有生物的基因组中，并且具有高度遗传稳定性易于自动化分析。EST标记技术，中文译为表达序列标签，EST的出现是开发微卫星标记的一个重要资源。EST是一段短的cDNA序列,大约200700bp。EST可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因,所以被称之为“表达序列标签”。
目前，微卫星标记已广泛应用于动植物的相关研究中，近年来，微卫星标记在昆虫学研究中的应用取得了长足进展，极大的促进了昆虫学研究的发展。（1）微卫星标记在昆虫地理种群上的应用。Caldera等[10]应用微卫星标记和线粒体DNA研究入侵美国的红火蚁Solenopsis invicta时，发现了入侵种群来自于特定地理种群的现象；Chu等[11]通过比较线粒体DNA单倍型与微卫星等位基因发现，我国山东省Q型烟粉虱的来源种群具有地理偏倚性，而同样具有较高遗传多样性的东地中海Q型烟粉虱种群则没有传入山东省。（2）微卫星标记在昆虫入侵上的应用。在研究某些入侵昆虫时，微卫星标记比线粒体 DNA 标记更为有效，其中的关键是筛选出多态性高的微卫星位点[1213]。Tsutsui等应用微卫星标记和线粒体DNA研究阿根廷蚂蚁Linepithema humile的种群起源问题。根据历史记载，阿根廷蚂蚁于1913 年从阿根廷和巴西入侵北美大陆，但由于线粒体DNA多态性很低，未能获得入侵来源的信息。然而，多态性高的微卫星标记可以分析出北美大陆的阿根廷蚂蚁起源于阿根廷Pio Parama地区。（3）微卫星标记在昆虫迁飞习性上的应用。Guo 等[14]通过5个微卫星分子标记研究了我国麦长管蚜的15个地理种群遗传结构，发现东部平原各种群间的遗传距离较近，西部高原各种群间的遗传距离较远。推测在地理距离相当的情况下，地势可以阻碍迁飞但总趋势是遗传距离随地理距离的增大而增大的。（4）微卫星标记在昆虫行为和习性上的应用。Tronttietal[15]利用微卫星标记研究了斜结蚁3个种群的分布模式和交配行为；Kraaijeveldetal[16]利用微卫星分析地中海野生雌性果蝇的后代,发现在繁殖季节,雌性果蝇交尾的频率高是普遍现象,该研究结果为利用不育技术防治害虫奠定了一定的基础。（5）微卫星标记在昆虫种群遗传结构上的应用。龚鹏等通过微卫星引物PCR扩增方法,对不同季节上的棉蚜、不同寄主的棉蚜及不同蚜型的种群分化进行了DNA多态性研究。发现冬寄主上棉蚜种群分化较小,而冬寄主种群和夏寄主种群之间棉蚜有较大的遗传分化[1718]。
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