细菌harpin蛋白hrpzpsg结构域克隆及表达与功能研究
本研究依据丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea）Harpin蛋白hrpZPsg的结构预测结果，通过构建片段缺失突变体，研究该Harpin蛋白中诱导HR、促进植物生长和诱导植物抗病性的功能域。本实验采用反向PCR等技术构建了5个hrpZpsg片段缺失突变体。其中，hrpZ1、hrpZ2采用PCR法分别缺失1-240、195-346位氨基酸，hrpZ3、hrpZ4、hrpZ5采用反向PCR技术分别缺失89-124、126-152、144-152位氨基酸。将获得的片段构建于表达载体pET30a(+)上，并转化到表达菌株大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE检测结果表明5个hrpZPsg片段缺失突变体均能表达蛋白且大小与理论值相符。粗蛋白镍柱纯化、脱盐、超滤后获得纯蛋白，BCA标准法测得浓度约为4.0 mg/mL，将所得纯蛋白在烟草上检测其激发烟草过敏反应的能力，检测结果显示与hrpZpsg相比，hrpZ1减弱；hrpZ2不能激发肉眼可见过敏反应，但经Trypan blue染色后在显微镜下能观察到明显的微敏反应；hrpZ3、hrpZ4、hrpZ5虽然缺失了部分氨基酸，但引起过敏反应的能力与hrpZPsg相比未见减弱。由此可知，C-端调控过敏反应，缺失后不能激发过敏反应，N-端缺失使激发过敏反应的能力减弱。
目录
关键词 1
Abstract. 1
Key words 2
1 材料与方法 3
1．1实验材料 3
1.2.1引物设计及片段特征 3
1.2.2 PCR扩增反应体系 4
1.2.3纯化PCR产物 4
1.2.4使用pMD18T载体对目的片段进行TA克隆 4
1.2.5连接产物的转化 5
1.2.6质粒的提取 5
1.2.7质粒酶切及PCR验证 5
1.2.8构建重组质粒 6
1.2.9重组质粒的转化 6
1.2.10重组质粒的PCR筛选及验证 6
1.2.11活化表达菌株，提取粗蛋白 6
1.2.12 SDSPAGE凝胶电泳检测 6
1. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2.13镍柱清洗及蛋白纯化 7
1.2.14 hrpZ蛋白的脱盐和浓缩 7
1.2.15纯化hrpZ蛋白的浓度测定 7
2 结果与分析 8
2．１重组表达载体构建的验证 8
2.1.1丁香假单胞菌大豆致病变种hrpZPsgs1基因功能片段的克隆与表达载体构建 8
2．2 hrpZPsg功能片段的蛋白表达和纯化 9
2.2.1 hrpZPsg功能片段的蛋白表达 9
2.2.2粗蛋白的纯化 10
2.2.3蛋白纯化后的脱盐及浓度测定 10
2．3 hrpZ功能片段在烟草上的过敏反应 10
2.3.1 hrpZ功能片段表达蛋白激发烟草产生HR最底浓度检测结果 10
3 讨论 11
致谢 12
参考文献： 12
细菌Harpin蛋白HrpZPsg结构域克隆及表达与功能研究
引言
植物病原细菌的hrp基因簇除负责编码组装Ⅲ型分泌系统(T3SS)以及调控其他致病相关基因外，还编码能够激发非寄主或抗性植物过敏反应（hypersensitive response, HR）的非特异性蛋白激发子—Harpin蛋白。1992年韦忠民首次从梨火疫病菌（Erwinia amylovora）的hrp基因簇中鉴定到HarpinEa蛋白，能够在在烟草上激发HR，并且HR可以被真核生物代谢抑制剂抑制[1]。随后对Harpin 蛋白的研究得到广泛开展。Harpins蛋白的共同理化特征是均富含甘氨酸（Gly），少量或不含半胱氨酸（Cys），对热稳定，对蛋白K敏感，具有HR的功能域。Harpins通过III型泌出通道被运输到植物细胞内，在病原细菌侵染植物的过程中发挥作用。除HarpinPss外，其他Harpin均可以作为病原细菌的毒性因子起作用[2]。
迄今为止，关于Harpin蛋白的研究结果所反映的均是蛋白质激发子与非寄主植物的相互作用。Harpin至少可以激活3条信号通路，不同信号通路介导了不同的生物学效应。Harpin可以通过启动水杨酸（salicylic acid, SA）信号通路使植物获得系统抗病性（systemic acquired resistance, SAR）[34]。Harpin蛋白还可以通过启动茉莉酸（jasmonic acid, JA）/乙烯（Ethylene, ET）信号途径诱导植物抗虫与促进植物生长[5]，通过启动脱落酸（Abscisic acid，ABA）信号通路诱导植物抗旱[6]。但Harpin激发子在植物上的受体是什么和如何相互识别这一重要问题还不清楚。Hoyos等人进行了有意义的探索，发现HarpinPss的作用位点在细胞壁上，并且可能与细胞壁的果胶化物结合，需要Ca2+离子参与[7]。Kim和Miao等人也推测Harpin蛋白的作用位点也在细胞壁上[89]。而Lee等人研究则表明Harpin(HrpZPsp) 可以同时与烟草的微粒体膜和原生质膜结合，从而认为HrpZPsp与植物的结合位点位于原生质膜[10]。但是受体位于细胞中的哪一个部位尚没有统一的结论。推测不同Harpins可能有不同受体，或同一种Harpin可能不止一个受体。要解决这些问题，了解Harpin蛋白的作用细节以及如何与受体蛋白相互作用，首先要认清Harpin蛋白自身的空间结构和作用功能域。但是，迄今为止还未获得任何一种Harpin的晶体结构。虽然有些Harpin蛋白已经发现了HR功能域[1112]。但在功能域研究方面也没有取得较大的突破。
本项目前期已从丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea）克隆到大小为1038 bp的hrpZ基因，并利用大肠杆菌表达。研究表明，Harpin（HrpZPsg）具有该类蛋白的典型特征，如对热稳定，对蛋白K敏感，在非寄主植物激发HR等。hrpZPsg可以促进烟草的生长，显著提高烟草对TMV和疫霉的抗性。作用机理研究表明hrpZPsg能激发HCD标志基因hsr203J、hsr515的表达，同时伴随SAR正调控因子npr1，植保素合成限速酶基因Pal，PR蛋白家族基因PR1a、Chia5的表达，但未检测到乙烯信号通路的转录调控因子EIN2的表达，说明hrpZPsg诱导烟草产生的SAR是依赖于水杨酸信号途径[13]。为了研究hrpZPsg的作用机理，本项目鉴于Harpin蛋白结晶分析工作的困难性，本项目拟解析决定hrpZPsg生物学效应的功能结构域，采用分子生物学等方法，对hrpZPsg进行片段缺失、替换和重排等，得到重组的hrpZPsg；采用促生、抗病等表型实验研究重组hrpZPsg的生物学效应。研究能为改造Harpin类激发子，提高该类产品的应用稳定性和效果提供靶标分子。
目录
关键词 1
Abstract. 1
Key words 2
1 材料与方法 3
1．1实验材料 3
1.2.1引物设计及片段特征 3
1.2.2 PCR扩增反应体系 4
1.2.3纯化PCR产物 4
1.2.4使用pMD18T载体对目的片段进行TA克隆 4
1.2.5连接产物的转化 5
1.2.6质粒的提取 5
1.2.7质粒酶切及PCR验证 5
1.2.8构建重组质粒 6
1.2.9重组质粒的转化 6
1.2.10重组质粒的PCR筛选及验证 6
1.2.11活化表达菌株，提取粗蛋白 6
1.2.12 SDSPAGE凝胶电泳检测 6
1. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2.13镍柱清洗及蛋白纯化 7
1.2.14 hrpZ蛋白的脱盐和浓缩 7
1.2.15纯化hrpZ蛋白的浓度测定 7
2 结果与分析 8
2．１重组表达载体构建的验证 8
2.1.1丁香假单胞菌大豆致病变种hrpZPsgs1基因功能片段的克隆与表达载体构建 8
2．2 hrpZPsg功能片段的蛋白表达和纯化 9
2.2.1 hrpZPsg功能片段的蛋白表达 9
2.2.2粗蛋白的纯化 10
2.2.3蛋白纯化后的脱盐及浓度测定 10
2．3 hrpZ功能片段在烟草上的过敏反应 10
2.3.1 hrpZ功能片段表达蛋白激发烟草产生HR最底浓度检测结果 10
3 讨论 11
致谢 12
参考文献： 12
细菌Harpin蛋白HrpZPsg结构域克隆及表达与功能研究
引言
植物病原细菌的hrp基因簇除负责编码组装Ⅲ型分泌系统(T3SS)以及调控其他致病相关基因外，还编码能够激发非寄主或抗性植物过敏反应（hypersensitive response, HR）的非特异性蛋白激发子—Harpin蛋白。1992年韦忠民首次从梨火疫病菌（Erwinia amylovora）的hrp基因簇中鉴定到HarpinEa蛋白，能够在在烟草上激发HR，并且HR可以被真核生物代谢抑制剂抑制[1]。随后对Harpin 蛋白的研究得到广泛开展。Harpins蛋白的共同理化特征是均富含甘氨酸（Gly），少量或不含半胱氨酸（Cys），对热稳定，对蛋白K敏感，具有HR的功能域。Harpins通过III型泌出通道被运输到植物细胞内，在病原细菌侵染植物的过程中发挥作用。除HarpinPss外，其他Harpin均可以作为病原细菌的毒性因子起作用[2]。
迄今为止，关于Harpin蛋白的研究结果所反映的均是蛋白质激发子与非寄主植物的相互作用。Harpin至少可以激活3条信号通路，不同信号通路介导了不同的生物学效应。Harpin可以通过启动水杨酸（salicylic acid, SA）信号通路使植物获得系统抗病性（systemic acquired resistance, SAR）[34]。Harpin蛋白还可以通过启动茉莉酸（jasmonic acid, JA）/乙烯（Ethylene, ET）信号途径诱导植物抗虫与促进植物生长[5]，通过启动脱落酸（Abscisic acid，ABA）信号通路诱导植物抗旱[6]。但Harpin激发子在植物上的受体是什么和如何相互识别这一重要问题还不清楚。Hoyos等人进行了有意义的探索，发现HarpinPss的作用位点在细胞壁上，并且可能与细胞壁的果胶化物结合，需要Ca2+离子参与[7]。Kim和Miao等人也推测Harpin蛋白的作用位点也在细胞壁上[89]。而Lee等人研究则表明Harpin(HrpZPsp) 可以同时与烟草的微粒体膜和原生质膜结合，从而认为HrpZPsp与植物的结合位点位于原生质膜[10]。但是受体位于细胞中的哪一个部位尚没有统一的结论。推测不同Harpins可能有不同受体，或同一种Harpin可能不止一个受体。要解决这些问题，了解Harpin蛋白的作用细节以及如何与受体蛋白相互作用，首先要认清Harpin蛋白自身的空间结构和作用功能域。但是，迄今为止还未获得任何一种Harpin的晶体结构。虽然有些Harpin蛋白已经发现了HR功能域[1112]。但在功能域研究方面也没有取得较大的突破。
本项目前期已从丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea）克隆到大小为1038 bp的hrpZ基因，并利用大肠杆菌表达。研究表明，Harpin（HrpZPsg）具有该类蛋白的典型特征，如对热稳定，对蛋白K敏感，在非寄主植物激发HR等。hrpZPsg可以促进烟草的生长，显著提高烟草对TMV和疫霉的抗性。作用机理研究表明hrpZPsg能激发HCD标志基因hsr203J、hsr515的表达，同时伴随SAR正调控因子npr1，植保素合成限速酶基因Pal，PR蛋白家族基因PR1a、Chia5的表达，但未检测到乙烯信号通路的转录调控因子EIN2的表达，说明hrpZPsg诱导烟草产生的SAR是依赖于水杨酸信号途径[13]。为了研究hrpZPsg的作用机理，本项目鉴于Harpin蛋白结晶分析工作的困难性，本项目拟解析决定hrpZPsg生物学效应的功能结构域，采用分子生物学等方法，对hrpZPsg进行片段缺失、替换和重排等，得到重组的hrpZPsg；采用促生、抗病等表型实验研究重组hrpZPsg的生物学效应。研究能为改造Harpin类激发子，提高该类产品的应用稳定性和效果提供靶标分子。
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