跳虫的宏条形码技术应用初探
跳虫又称粘管虫，是弹尾纲动物的俗称。作为三大土壤动物（线虫、螨、跳虫）之一，跳虫广泛分布于各种陆生环境，并在土壤节肢动物中有着独特的分类学意义。本课题以线粒体COI基因作为分子标记，结合DNA条形码和第二代测序技术对5种跳虫的混合样本进行物种鉴定的初步研究，利用相关生物学软件对数据进行处理分析，最终宏条码技术检测出了全部跳虫。本实验对DNA宏条形码技术在跳虫中应用的可能性进行了初步探讨，并为今后土壤生物多样性、物种监测、食性分析等相关研究提供了思路和技术路线。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验仪器与试剂 2
1.2.1实验仪器2
1.2.2实验试剂2
1.3实验步骤3
1.3.1 DNA的单样提取3
1.3.2 PCR扩增3
1.3.3 电泳及常规测序3
1.3.4 形态学数据的获取4
1.3.5 DNA的混合提取4
1.3.6 PCR扩增4
1.3.7 电泳及高通量测序4
2 数据处理与分析4
2.1 系统、软件及数据库4
2.1.1 系统4
2.1.2 软件5
2.1.3 数据库5
2.2 数据处理5
2.2.1 单样DNA序列拼接5
2.2.2 混池DNA序列引物接头的剪切5
2.2.3 质量控制5
2.2.4 OTU聚类7
2.2.5 分类学注释7
3 结果与分析 8
3.1 PCR产物电泳检测8
3.2 OUT的聚类及代表序列的选取8
3.3 物种组成分析10
4 讨论11
致谢11
参考文献13
图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果8
图2 体长与有效序列数目关系8
表1 单样DNA PCR所用分子标记、引物、文献来源3< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
br /> 表2 本实验所用样本的分类学资料4
表3 混池DNA PCR所用分子标记、引物、文献来源4
表4 多种距离阈值聚类结果8
表5 90%阈值下各OTU聚类结果8
表6 95%阈值下各OTU聚类结果9
表7 97%阈值下各OTU聚类结果9
表8 实验材料体长及平均有效数列数目9
表9 相似度阈值为90%时的物种组成结果10
表10 相似度阈值为95%时的物种组成结果10
表11相似度阈值为97%时的物种组成结果11
跳虫的宏条形码技术应用初探
引言
引言
跳虫（springtails），又称粘管虫，是弹尾纲（Collembola）动物的俗称。它广泛分布于各种陆生环境，其种类和数量都很丰富，是三大土壤动物（线虫、螨、跳虫）之一。它不仅能直接分解腐败植物，也能间接影响真菌的分布和生长，是土壤中最重要的功能类群之一[1]。因此，将跳虫作为土壤动物的模式物种，对其进行准确物种鉴定是研究和利用生物多样性的前提。常规物种鉴定需要建立在形态学特征的基础上，不仅需要拥有丰富经验的分类学家，还需要耗费大量的时间精力，但往往并不一定能将所有物种鉴定到种的水平[2]。除此之外，生物的表型可塑性、隐种的存在以及个别物种在胚后发育不同时期存在的形态学差异也会导致鉴定错误。以上这些局限性说明了单纯依靠形态学对物种进行鉴定的困难，迫切需要新的方法思路改善目前物种的分类鉴定状况[3]。
Hebert等[2]于2003年正式提出了DNA条形码技术（DNA barcoding）的概念，该技术通过一段或几段长度合适的、通用DNA序列对生物界中现有物种进行快速、准确、自动化标记的识别鉴定技术。从此，DNA条形码广泛应用于植物、真菌、纤毛虫、腹足类、蜘蛛、甲壳动物、昆虫、鱼类、两栖类、鸟类以及灵长类等多个类群的生物学研究中[4]。DNA条形码技术作为传统分类学的有力补充，将鉴定过程进行标准化，避免了在分类过程中对经验的一味依赖，无论是在生物多样性、分子系统发育与进化、生物检疫，还是在食品安全、法医学、流行病学等多种领域均具有广阔的应用前景[5]。
尽管DNA条形码技术为物种快速鉴定提供了一定程度的帮助，但在实际研究中，仍存在一些局限性：其一，DNA容易发生降解，导致长片段破碎化；其二，传统测序技术只适用于少样品量的测序，而不适用于大规模物种鉴定。第二代测序技术的出现恰能克服DNA条形码技术的以上局限性。DNA条形码技术与第二代测序技术的结合推动了DNA宏条形码技术的产生和DNA宏分类学（DNA metasystematics）的发展[6]。
宏条形码技术的设计思路最初来源于环境微生物的研究[7]。根据样本来源不同可分为两类：一类是来源于环境样本，一类是来源于混合样本。通过提取环境样本（土壤、水、粪便等）或混合样本的DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，结合DNA条形码和第二代测序技术，从而实现对可操纵分类单元（operational taxonomic units，OTUs）进行物种鉴定的技术称为环境DNA或DNA宏条形码技术[8]，该技术解决了DNA条形码的技术障碍，摆脱了对传统形态学物种鉴定经验的过度依赖，极大提高了物种鉴定的准确性和效率。近年来，宏条形码技术在生物多样性、物种监测及食性分析等方面的应用均取得了显著进展。
本课题从分子生物学角度出发，以线粒体COI基因作为分子标记，结合DNA条形码和第二代测序技术对跳虫混合样本进行物种分类的相关研究，并利用相关生物信息学软件对数据进行处理分析，最终从分子角度上检测出了5种跳虫；对DNA宏条形码技术在跳虫中应用的可能性进行了初步探讨，并为今后土壤生物多样性、物种监测、食性分析等相关研究提供参考。
1 材料与方法
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验仪器与试剂 2
1.2.1实验仪器2
1.2.2实验试剂2
1.3实验步骤3
1.3.1 DNA的单样提取3
1.3.2 PCR扩增3
1.3.3 电泳及常规测序3
1.3.4 形态学数据的获取4
1.3.5 DNA的混合提取4
1.3.6 PCR扩增4
1.3.7 电泳及高通量测序4
2 数据处理与分析4
2.1 系统、软件及数据库4
2.1.1 系统4
2.1.2 软件5
2.1.3 数据库5
2.2 数据处理5
2.2.1 单样DNA序列拼接5
2.2.2 混池DNA序列引物接头的剪切5
2.2.3 质量控制5
2.2.4 OTU聚类7
2.2.5 分类学注释7
3 结果与分析 8
3.1 PCR产物电泳检测8
3.2 OUT的聚类及代表序列的选取8
3.3 物种组成分析10
4 讨论11
致谢11
参考文献13
图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果8
图2 体长与有效序列数目关系8
表1 单样DNA PCR所用分子标记、引物、文献来源3< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
br /> 表2 本实验所用样本的分类学资料4
表3 混池DNA PCR所用分子标记、引物、文献来源4
表4 多种距离阈值聚类结果8
表5 90%阈值下各OTU聚类结果8
表6 95%阈值下各OTU聚类结果9
表7 97%阈值下各OTU聚类结果9
表8 实验材料体长及平均有效数列数目9
表9 相似度阈值为90%时的物种组成结果10
表10 相似度阈值为95%时的物种组成结果10
表11相似度阈值为97%时的物种组成结果11
跳虫的宏条形码技术应用初探
引言
引言
跳虫（springtails），又称粘管虫，是弹尾纲（Collembola）动物的俗称。它广泛分布于各种陆生环境，其种类和数量都很丰富，是三大土壤动物（线虫、螨、跳虫）之一。它不仅能直接分解腐败植物，也能间接影响真菌的分布和生长，是土壤中最重要的功能类群之一[1]。因此，将跳虫作为土壤动物的模式物种，对其进行准确物种鉴定是研究和利用生物多样性的前提。常规物种鉴定需要建立在形态学特征的基础上，不仅需要拥有丰富经验的分类学家，还需要耗费大量的时间精力，但往往并不一定能将所有物种鉴定到种的水平[2]。除此之外，生物的表型可塑性、隐种的存在以及个别物种在胚后发育不同时期存在的形态学差异也会导致鉴定错误。以上这些局限性说明了单纯依靠形态学对物种进行鉴定的困难，迫切需要新的方法思路改善目前物种的分类鉴定状况[3]。
Hebert等[2]于2003年正式提出了DNA条形码技术（DNA barcoding）的概念，该技术通过一段或几段长度合适的、通用DNA序列对生物界中现有物种进行快速、准确、自动化标记的识别鉴定技术。从此，DNA条形码广泛应用于植物、真菌、纤毛虫、腹足类、蜘蛛、甲壳动物、昆虫、鱼类、两栖类、鸟类以及灵长类等多个类群的生物学研究中[4]。DNA条形码技术作为传统分类学的有力补充，将鉴定过程进行标准化，避免了在分类过程中对经验的一味依赖，无论是在生物多样性、分子系统发育与进化、生物检疫，还是在食品安全、法医学、流行病学等多种领域均具有广阔的应用前景[5]。
尽管DNA条形码技术为物种快速鉴定提供了一定程度的帮助，但在实际研究中，仍存在一些局限性：其一，DNA容易发生降解，导致长片段破碎化；其二，传统测序技术只适用于少样品量的测序，而不适用于大规模物种鉴定。第二代测序技术的出现恰能克服DNA条形码技术的以上局限性。DNA条形码技术与第二代测序技术的结合推动了DNA宏条形码技术的产生和DNA宏分类学（DNA metasystematics）的发展[6]。
宏条形码技术的设计思路最初来源于环境微生物的研究[7]。根据样本来源不同可分为两类：一类是来源于环境样本，一类是来源于混合样本。通过提取环境样本（土壤、水、粪便等）或混合样本的DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，结合DNA条形码和第二代测序技术，从而实现对可操纵分类单元（operational taxonomic units，OTUs）进行物种鉴定的技术称为环境DNA或DNA宏条形码技术[8]，该技术解决了DNA条形码的技术障碍，摆脱了对传统形态学物种鉴定经验的过度依赖，极大提高了物种鉴定的准确性和效率。近年来，宏条形码技术在生物多样性、物种监测及食性分析等方面的应用均取得了显著进展。
本课题从分子生物学角度出发，以线粒体COI基因作为分子标记，结合DNA条形码和第二代测序技术对跳虫混合样本进行物种分类的相关研究，并利用相关生物信息学软件对数据进行处理分析，最终从分子角度上检测出了5种跳虫；对DNA宏条形码技术在跳虫中应用的可能性进行了初步探讨，并为今后土壤生物多样性、物种监测、食性分析等相关研究提供参考。
1 材料与方法
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