抗吡虫啉苹果绵蚜nachr亚基基因elα2和elα5的序列分析
苹果绵蚜是果树的重要检疫性害虫，近年来危害日趋严重。由于不合理的使用国内部分地区苹果绵蚜对吡虫啉已产生了极高水平抗性。吡虫啉是第一个开发出来的新烟碱类杀虫剂，其作用靶标为昆虫烟碱型乙酰胆碱受体。目前，与新烟碱类杀虫剂相关的抗性研究主要集中在代谢抗性和靶标抗性两方面。为了明确苹果绵蚜对吡虫啉的抗性机理，本文比较分析了苹果绵蚜两个已知nAChR基因Elα2和Elα5的序列差异，结果发现不同种群Elα2和Elα5存在一系列的氨基酸多态性，推测可能与苹果绵蚜对吡虫啉的抗性有关。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1供试蚜虫 2
1.2 主要试剂和仪器2
1.2.1 主要试剂2
1.2.2 主要仪器2
1.3 总RNA提取2
1.3.1 总RNA提取2
1.3.2 苹果绵蚜总RNA质量检测3
1.4引物3
1.5 PCR扩增3
1.6 PCR产物回收与纯化3
1.7 质粒载体的连接与转化4
1.7.1 连接反应4
1.7.2 转化反应与单克隆培养4
1.7.3 挑斑4
1.8 序列分析4
2 苹果绵蚜烟碱型乙酰胆碱受体基因的点突变分析5
2.1不同苹果绵蚜种群Elα2和Elα5的克隆5
2.2 不同地区苹果绵蚜的Elα2和Elα5氨基酸多态性分析6
2.3 讨论与分析9
致谢10
参考文献10
抗吡虫啉苹果绵蚜nAChR亚基基因Elα2和Elα5的序列分析
引言
引言
苹果绵蚜Eriosoma lanigerum（Hausmann）是一种重要的检疫性有害昆虫，在我国分布广泛，对苹果树危害严重【1】。主要寄生于苹果树枝干的新梢、伤口、叶腋、果梗、萼洼以及地下根部和根基等处为害，通过吸取树汁，从而削弱树势继而影响苹果树的生长、发育和花芽分化、影响苹果产量和质量【2】。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
吡虫啉（Imidacloprid）是第一个开发出来的新烟碱类杀虫剂（Neonicotinonids），新烟碱类杀虫剂的作用靶标为昆虫烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）【3】。由于长期频繁的使用，据不完全统计，已有包括烟粉虱、稻飞虱、烟蚜【4】等多种农业害虫对吡虫啉产生了抗性，许多研究表明，nAChR亚基氨基酸残基的缺失或者替换会导致昆虫抗性水平的改变【57】。Liu等（2005）在褐飞虱nAChRα1（Nlα1）亚基、nAChRα3（Nlα3）亚基中发现与吡虫啉抗性相关的突变位点，结果表明该突变可显著影响吡虫啉对褐飞虱Nlα1亚基的结合能力【8】。Bass等（2011）发现，桃蚜的nAChRβ1亚基的Loop环上存在突变使得桃蚜对吡虫啉的抗性水平升高【9】。Koo等（2014）也发现棉蚜nAChRβ1亚基的突变是导致抗性产生的重要原因【10】。
祝菁等（2016）在2015年和2016年对新疆察布查尔、山东济南和江苏丰县苹果绵蚜进行了常用药剂的抗性监测，结果表明，这些地区的苹果绵蚜对吡虫啉产生了高至极高水平的抗性，不同地区的苹果绵蚜的抗性水平有所差异，并克隆获得苹果绵蚜两个nAChR基因Elα2和Elα5的全长序列，同时将不同抗性水平的苹果绵蚜种群进行了这两个基因序列的比较，结果初步表明在不同抗性种群中两个亚基存在一系列的氨基酸多态性，推测可能与苹果绵蚜对吡虫啉的抗性有关【11】。
本研究通过对2016年采集的新疆新源和江苏丰县苹果绵蚜，继续比较Elα2和Elα5基因的序列，验证之前的结果，以期为苹果绵蚜对吡虫啉抗性机理的阐明提供可靠的科学依据。
1 材料与方法
1.1供试蚜虫
苹果绵蚜于2016年分别采自江苏丰县和新疆新源县，选取健康无翅成蚜，液氮速冻并放于80℃冰箱保存备用。
1.2主要试剂和仪器
1.2.1主要试剂
Trizol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司、Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒购自Kakara公司、 DNA凝胶回收试剂盒购自AxyPrep公司、T3质粒和T1大肠杆菌购自TRANSGEN BIOTECH公司、2×Taq Master Mix（Dye Plus）购自Vazyme公司。
1.2.2主要仪器
PCR 扩增仪PTC200（Thermocycler MJ research公司）；水平式核酸电泳仪(北京市六一仪器厂)；凝胶成像系统Gel Doc2000（美国BioRad公司）；超低温冰箱FORMA 906（美国Thermo Electron公司）；离心机Centrifuge 5424、离心机5145D（德国Eppendoff公司）。
1.3总RNA提取
1.3.1总RNA提取
每个苹果绵蚜种群取成虫20头左右，按照Trizol试剂说明进行总RNA提取，每个种群5个重复。提取步骤如下:
①将20头左右苹果绵蚜放入匀浆器内，加液氮充分研磨均匀；加1000μL Trizol试剂，充分研磨混匀，取1.5 mL Eppendorf管，倒入匀浆液；
②在4 ℃，转速12,000g条件下离心15 min，将所得上清液轻轻倒入新的1.5 mL EP管中；
③每管样品加入200μL氯仿，盖紧EP管，剧烈震动约15s，常温静置约10min；
④在4 ℃，转速12,000g条件下离心15 min，此时管内液体分为三层，小心移取200μL上清液于新EP管中；加入200μL异丙醇沉淀RNA，缓慢的上下颠倒710次，温柔混匀，然后置于冰上10min；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1供试蚜虫 2
1.2 主要试剂和仪器2
1.2.1 主要试剂2
1.2.2 主要仪器2
1.3 总RNA提取2
1.3.1 总RNA提取2
1.3.2 苹果绵蚜总RNA质量检测3
1.4引物3
1.5 PCR扩增3
1.6 PCR产物回收与纯化3
1.7 质粒载体的连接与转化4
1.7.1 连接反应4
1.7.2 转化反应与单克隆培养4
1.7.3 挑斑4
1.8 序列分析4
2 苹果绵蚜烟碱型乙酰胆碱受体基因的点突变分析5
2.1不同苹果绵蚜种群Elα2和Elα5的克隆5
2.2 不同地区苹果绵蚜的Elα2和Elα5氨基酸多态性分析6
2.3 讨论与分析9
致谢10
参考文献10
抗吡虫啉苹果绵蚜nAChR亚基基因Elα2和Elα5的序列分析
引言
引言
苹果绵蚜Eriosoma lanigerum（Hausmann）是一种重要的检疫性有害昆虫，在我国分布广泛，对苹果树危害严重【1】。主要寄生于苹果树枝干的新梢、伤口、叶腋、果梗、萼洼以及地下根部和根基等处为害，通过吸取树汁，从而削弱树势继而影响苹果树的生长、发育和花芽分化、影响苹果产量和质量【2】。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
吡虫啉（Imidacloprid）是第一个开发出来的新烟碱类杀虫剂（Neonicotinonids），新烟碱类杀虫剂的作用靶标为昆虫烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）【3】。由于长期频繁的使用，据不完全统计，已有包括烟粉虱、稻飞虱、烟蚜【4】等多种农业害虫对吡虫啉产生了抗性，许多研究表明，nAChR亚基氨基酸残基的缺失或者替换会导致昆虫抗性水平的改变【57】。Liu等（2005）在褐飞虱nAChRα1（Nlα1）亚基、nAChRα3（Nlα3）亚基中发现与吡虫啉抗性相关的突变位点，结果表明该突变可显著影响吡虫啉对褐飞虱Nlα1亚基的结合能力【8】。Bass等（2011）发现，桃蚜的nAChRβ1亚基的Loop环上存在突变使得桃蚜对吡虫啉的抗性水平升高【9】。Koo等（2014）也发现棉蚜nAChRβ1亚基的突变是导致抗性产生的重要原因【10】。
祝菁等（2016）在2015年和2016年对新疆察布查尔、山东济南和江苏丰县苹果绵蚜进行了常用药剂的抗性监测，结果表明，这些地区的苹果绵蚜对吡虫啉产生了高至极高水平的抗性，不同地区的苹果绵蚜的抗性水平有所差异，并克隆获得苹果绵蚜两个nAChR基因Elα2和Elα5的全长序列，同时将不同抗性水平的苹果绵蚜种群进行了这两个基因序列的比较，结果初步表明在不同抗性种群中两个亚基存在一系列的氨基酸多态性，推测可能与苹果绵蚜对吡虫啉的抗性有关【11】。
本研究通过对2016年采集的新疆新源和江苏丰县苹果绵蚜，继续比较Elα2和Elα5基因的序列，验证之前的结果，以期为苹果绵蚜对吡虫啉抗性机理的阐明提供可靠的科学依据。
1 材料与方法
1.1供试蚜虫
苹果绵蚜于2016年分别采自江苏丰县和新疆新源县，选取健康无翅成蚜，液氮速冻并放于80℃冰箱保存备用。
1.2主要试剂和仪器
1.2.1主要试剂
Trizol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司、Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒购自Kakara公司、 DNA凝胶回收试剂盒购自AxyPrep公司、T3质粒和T1大肠杆菌购自TRANSGEN BIOTECH公司、2×Taq Master Mix（Dye Plus）购自Vazyme公司。
1.2.2主要仪器
PCR 扩增仪PTC200（Thermocycler MJ research公司）；水平式核酸电泳仪(北京市六一仪器厂)；凝胶成像系统Gel Doc2000（美国BioRad公司）；超低温冰箱FORMA 906（美国Thermo Electron公司）；离心机Centrifuge 5424、离心机5145D（德国Eppendoff公司）。
1.3总RNA提取
1.3.1总RNA提取
每个苹果绵蚜种群取成虫20头左右，按照Trizol试剂说明进行总RNA提取，每个种群5个重复。提取步骤如下:
①将20头左右苹果绵蚜放入匀浆器内，加液氮充分研磨均匀；加1000μL Trizol试剂，充分研磨混匀，取1.5 mL Eppendorf管，倒入匀浆液；
②在4 ℃，转速12,000g条件下离心15 min，将所得上清液轻轻倒入新的1.5 mL EP管中；
③每管样品加入200μL氯仿，盖紧EP管，剧烈震动约15s，常温静置约10min；
④在4 ℃，转速12,000g条件下离心15 min，此时管内液体分为三层，小心移取200μL上清液于新EP管中；加入200μL异丙醇沉淀RNA，缓慢的上下颠倒710次，温柔混匀，然后置于冰上10min；
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