终极腐霉菌lamp快速检测方法的建立
终极腐霉菌是一种寄主范围广且危害严重的植物病原菌。本研究利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的终极腐霉检测方法。以枯草杆菌蛋白酶基因PYU1_T014233为靶序列，设计LAMP特异性引物，建立LAMP反应体系与条件，整个过程仅需60分钟，即可通过肉眼直接目测试验结果。反应后经琼脂糖凝胶进行电泳验证和扩增前加入燃料HNB（羟基萘酚蓝）作为反应指示剂验证扩增结果。特异性检测中，终极腐霉能扩增到梯形状的条带，同时HNB显色观察到天蓝色阳性反应，而其它腐霉和疫霉均没有观察到这些现象；在灵敏度检测中，终极腐霉LAMP技术最低检测限达到100 pg﹒μL-1。本研究建立的LAMP检测方法为终极腐霉的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1 实验菌株 3
1.1.2 实验试剂 3
1.1.3培养基 3
1.1.4 主要仪器 4
1.2方法 4
1.2.1 液培菌株菌丝 4
1.2.2基因组提取 4
1.2.3 利用ITS序列鉴定腐霉菌株 5
1.2.3.2 PCR产物的切胶回收 6
1.2.3.3 目的片段与pMD19T载体的连接 6
1.2.3.4 大肠轩菌DH5α感受态细胞的制备 6
1.2.3.5热激转化大肠杆菌 7
1.2.3.6 菌落PCR鉴定 7
1.2.3.7抽提质粒并测序 8
1.2.4 LAMP 8
1.2.4.1 LAMP技术的引物设计 9
1.2.4.2终极腐霉LAMP技术体系建立 9
1.2.4.3终极腐霉的LAMP技术的灵敏度实验 9
2 结果与分析 9
2.1利用菌株的ITS序列鉴定腐霉菌株 9
2.2 LAMP技术的引 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
物设计 11
2.3终极腐霉LAMP技术体系建立 12
2.4终极腐霉的LAMP技术的灵敏度实验 12
2.5终极腐霉回接寄主，发病部位进行LAMP检测 13
3讨论 14
致谢 15
参考文献： 15
终极腐霉菌LAMP快速检测方法的建立
引言
引言
腐霉菌隶属腐霉属（Pythium）腐霉科（Pythiaceae）霜霉目（Perenosporales）卵菌纲（Oomycetes）藻物界（Chromista）[1]。腐霉菌是多种植物病害的病原菌，能引起苗腐、根腐、根茎腐及果和种子腐烂甚至植物猝倒等，对农业生产损失严重[2]。
目前，全世界总计报道过的腐霉菌有200多种，我国共报道过腐霉菌有62种，其中能侵染植物引起病害的有40种[3, 4]。腐霉（Pythium）的寄主范围非常广泛，能侵染多种豆科、葫芦科、茄科、禾本科等植物造成不同程度的腐烂症状，已成为许多农作物苗期病害重要致病菌之一。番茄茎基腐病的病原为终极腐霉（Pythium ultimum），是番茄生长过程中的主要腐霉病害，该病原菌广泛分布于土壤中。在番茄的整个生育期均有发生，其在番茄苗期发生尤为严重。随着大棚蔬菜种植技术的推广普及，人为改善大棚的内部环境条件，使大棚内部终年呈现高温高湿环境，也为各种病原微生物的生长繁殖条件提供了良好，从而导致各种病害的频繁发生，这些条件更是利于番茄茎基腐病的发生，使番茄严重减产。
由于不同的腐霉菌引起的病害症状极为相似，传统的检测方法是依据腐霉的形态学进行分离鉴定，但是腐霉菌形态多变，性器官发育不稳定，其鉴定还比较困难。因此建立一种快速检测终极腐霉（Pythium ultimum）的方法对植物疫病的控制非常重要。环介导等温扩增技术（Loopmediated isothermal amplification, LAMP）是日本荣研株式会社发明的一种核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。环介导等温扩增技术是由Notomi等在2000年报道的能够识别保守DNA序列的6个特异性片段的4 条引物（2 条外引物和2 条内引物），利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）进行扩增反应的一种等温扩增技术[5]。LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现恒温扩增[6]。LAMP（环介导等温扩增）具有很高的专一性，它要求四种引物在靶基因上的6个不同部位完全匹配才能进行扩增，具有很高的特异性。引物设计是反应的关键，设计的总体原则是提高扩增的效率和特异性，它要求四种引物在靶序列上的6个不同部位完全匹配才能进行扩增。引物由目标DNA序列及其互补序列构成，分为2条内引物和2条外引物（摘自Eiken Co.Ltd网站）。内引物FIP和BIP含有2个显著区域，FIP含有F1区域的互补序列FIC，F2区域的靶序列(FlcF2)以及TTTT连接子。BIP引物含有B1区的互补序列B1C，B2区域的靶序列B2(BlcB2)以及TTTT连接子[4]。
自2000 年日本学者Notomi 等发明一种新型的环介导恒温扩增法（LAMP）以来，该技术已经广泛应用于对细菌、真菌、病毒等病原菌的检测[7] [8]；LAMP技术已经广泛应用于食品致病菌检测，如可快速准确检测出致病性大肠杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌等[9]。随着生物技术飞快发展，LAMP技术也被很多研究学者应用于植物病原细菌的研究。西瓜噬酸菌、水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌均为我国重要的检疫性种传细菌病害，白飒等人建立了检测西瓜噬酸菌和稻黄单胞菌的环介导等温扩增技术[10]。基于LAMP技术检测植物病原真菌方面，戴婷婷等就以 Ypt1 基因作为靶标，利用环介导等温扩增（LAMP）技术，成功建立了针对大豆疫霉的PsYpt1LAMP 检测技术。另外在辣椒疫霉和橡树疫霉上均有学者建立了快速的环介导等温扩增方法[6, 11]。大豆的其他病害如大豆茎褐腐病菌(PGS) 侵染大豆植株引起大豆茎褐腐病，吴旭东等也建立了大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测方法[12]。植物病毒病的识别、诊断及病原鉴定往往比真菌和细菌病害复杂得多，Fukuta等人首先应用该技术直接从受侵染的叶片、茎、根、种子中，成功的快速检测出了日本红薯花叶病毒(JYMV)[13]。之后科学家们又相继应用RTLAMP技术检测出了马铃薯Y病毒(PVY)、菊花的番茄不孕病毒(TAV) 兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)、水稻条纹病毒(RSV)、水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)和水稻瞬间黄化病毒(RTYV)等[1417]。
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摘要1
关键词1
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Key words1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1 实验菌株 3
1.1.2 实验试剂 3
1.1.3培养基 3
1.1.4 主要仪器 4
1.2方法 4
1.2.1 液培菌株菌丝 4
1.2.2基因组提取 4
1.2.3 利用ITS序列鉴定腐霉菌株 5
1.2.3.2 PCR产物的切胶回收 6
1.2.3.3 目的片段与pMD19T载体的连接 6
1.2.3.4 大肠轩菌DH5α感受态细胞的制备 6
1.2.3.5热激转化大肠杆菌 7
1.2.3.6 菌落PCR鉴定 7
1.2.3.7抽提质粒并测序 8
1.2.4 LAMP 8
1.2.4.1 LAMP技术的引物设计 9
1.2.4.2终极腐霉LAMP技术体系建立 9
1.2.4.3终极腐霉的LAMP技术的灵敏度实验 9
2 结果与分析 9
2.1利用菌株的ITS序列鉴定腐霉菌株 9
2.2 LAMP技术的引 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
物设计 11
2.3终极腐霉LAMP技术体系建立 12
2.4终极腐霉的LAMP技术的灵敏度实验 12
2.5终极腐霉回接寄主，发病部位进行LAMP检测 13
3讨论 14
致谢 15
参考文献： 15
终极腐霉菌LAMP快速检测方法的建立
引言
引言
腐霉菌隶属腐霉属（Pythium）腐霉科（Pythiaceae）霜霉目（Perenosporales）卵菌纲（Oomycetes）藻物界（Chromista）[1]。腐霉菌是多种植物病害的病原菌，能引起苗腐、根腐、根茎腐及果和种子腐烂甚至植物猝倒等，对农业生产损失严重[2]。
目前，全世界总计报道过的腐霉菌有200多种，我国共报道过腐霉菌有62种，其中能侵染植物引起病害的有40种[3, 4]。腐霉（Pythium）的寄主范围非常广泛，能侵染多种豆科、葫芦科、茄科、禾本科等植物造成不同程度的腐烂症状，已成为许多农作物苗期病害重要致病菌之一。番茄茎基腐病的病原为终极腐霉（Pythium ultimum），是番茄生长过程中的主要腐霉病害，该病原菌广泛分布于土壤中。在番茄的整个生育期均有发生，其在番茄苗期发生尤为严重。随着大棚蔬菜种植技术的推广普及，人为改善大棚的内部环境条件，使大棚内部终年呈现高温高湿环境，也为各种病原微生物的生长繁殖条件提供了良好，从而导致各种病害的频繁发生，这些条件更是利于番茄茎基腐病的发生，使番茄严重减产。
由于不同的腐霉菌引起的病害症状极为相似，传统的检测方法是依据腐霉的形态学进行分离鉴定，但是腐霉菌形态多变，性器官发育不稳定，其鉴定还比较困难。因此建立一种快速检测终极腐霉（Pythium ultimum）的方法对植物疫病的控制非常重要。环介导等温扩增技术（Loopmediated isothermal amplification, LAMP）是日本荣研株式会社发明的一种核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。环介导等温扩增技术是由Notomi等在2000年报道的能够识别保守DNA序列的6个特异性片段的4 条引物（2 条外引物和2 条内引物），利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）进行扩增反应的一种等温扩增技术[5]。LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现恒温扩增[6]。LAMP（环介导等温扩增）具有很高的专一性，它要求四种引物在靶基因上的6个不同部位完全匹配才能进行扩增，具有很高的特异性。引物设计是反应的关键，设计的总体原则是提高扩增的效率和特异性，它要求四种引物在靶序列上的6个不同部位完全匹配才能进行扩增。引物由目标DNA序列及其互补序列构成，分为2条内引物和2条外引物（摘自Eiken Co.Ltd网站）。内引物FIP和BIP含有2个显著区域，FIP含有F1区域的互补序列FIC，F2区域的靶序列(FlcF2)以及TTTT连接子。BIP引物含有B1区的互补序列B1C，B2区域的靶序列B2(BlcB2)以及TTTT连接子[4]。
自2000 年日本学者Notomi 等发明一种新型的环介导恒温扩增法（LAMP）以来，该技术已经广泛应用于对细菌、真菌、病毒等病原菌的检测[7] [8]；LAMP技术已经广泛应用于食品致病菌检测，如可快速准确检测出致病性大肠杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌等[9]。随着生物技术飞快发展，LAMP技术也被很多研究学者应用于植物病原细菌的研究。西瓜噬酸菌、水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌均为我国重要的检疫性种传细菌病害，白飒等人建立了检测西瓜噬酸菌和稻黄单胞菌的环介导等温扩增技术[10]。基于LAMP技术检测植物病原真菌方面，戴婷婷等就以 Ypt1 基因作为靶标，利用环介导等温扩增（LAMP）技术，成功建立了针对大豆疫霉的PsYpt1LAMP 检测技术。另外在辣椒疫霉和橡树疫霉上均有学者建立了快速的环介导等温扩增方法[6, 11]。大豆的其他病害如大豆茎褐腐病菌(PGS) 侵染大豆植株引起大豆茎褐腐病，吴旭东等也建立了大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测方法[12]。植物病毒病的识别、诊断及病原鉴定往往比真菌和细菌病害复杂得多，Fukuta等人首先应用该技术直接从受侵染的叶片、茎、根、种子中，成功的快速检测出了日本红薯花叶病毒(JYMV)[13]。之后科学家们又相继应用RTLAMP技术检测出了马铃薯Y病毒(PVY)、菊花的番茄不孕病毒(TAV) 兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)、水稻条纹病毒(RSV)、水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)和水稻瞬间黄化病毒(RTYV)等[1417]。
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