平沙绿僵菌njmp2103的杀虫谱测定
人们当前广泛使用的化学杀虫剂虽然为人来带来了便利和财富,但是大量使用化学杀虫剂引起生态平衡被破坏，害虫抗药性增强，害虫再猖獗问题,农药残留问题加剧。为解决这一问题，生物农药取代化学农药在生产中的利用十分重要。绿僵菌是一种对田间害虫有较高毒力的真菌，通过研究绿僵菌对各种田间害虫的毒力，可以更好的将绿僵菌这种生物杀虫剂投入生产使用。本实验采用的试验用绿僵菌来自从田间采集的僵虫中分离纯化得到的。对绿僵菌的杀虫谱的测定对以后绿僵菌的作用方式以及作用机理的研究打下基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料2
1．1．1供试菌株的研究与培养2
1．1．2 供试昆虫3
1．2 试验方法3
2 结果与分析4
2．1 实验结果4
2．1．1 观察结果4
2．1．2 死亡率统计7
2．2 实验结论 7
3 讨论 7
3．1 实验结果讨论7
致谢8
参考文献9
平沙绿僵菌NJMp2103的杀虫谱测定
引言
引言:在害虫的生物防治中，虫生真菌扮演着重要角色，其中绿僵菌是一种重要的生防真菌，生防真菌的优点是对环境友好、普遍毒性较低、不易使病虫产生抗药性、不会发生农药富集现象等优点，是生产无公害农产品优选的农药品种，因此，真菌杀虫剂研究开发与应用核心特征是保持和维护环境的相容性,必须在满足人类健康和合理的生态平衡前提下,使有益生物获得有效保护,有害生物得到很好的抑制,来促进农业现代化向更高层次发展,尽可能维系生态环境的动态平衡[1]。已成为当前农药和植保界研究的热门课题，越来越受到全球的重视。绿僵菌是一种（Metarhizium anisopliae）广谱杀虫真菌，目前已经证实可以寄生多个目、多个科的不同种昆虫，还有害螨和线虫。已经有多个国家把绿僵菌应用于害虫防治。相比于传统的化学农药，绿僵菌对人、畜无毒性，作用范围广泛，寄主众多，致病力广泛，无残留，持效时间长。目前，昆虫病原真菌 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
已经被开发为微生物农药用于防治蚜虫、粉虱、叶蝉、螨类等[3]。在所有被开发出来的昆虫病原真菌中，由于绿僵菌寄主范围较广泛，能寄生 200 种以上害虫，并且已经被开发为各种农药制剂，二十世纪八十年代以来，国内外学者已经开始从自然界寻找对农业害虫有致病力的病原真菌，并且已经开始使用生物测定的办法测定昆虫病原真菌对昆虫的毒力，但是大多数真菌的防治效果比较有限[12]。 绿僵菌是当前世界上研究和应用最多的虫生真菌之一,借助绿僵菌对害虫进行生物防治具有非常广阔的前景。全球对绿僵菌的研究已有多年的历史,但由于受到许多因素的制约,导致其大田实际防效不稳定,极大地制约了其规模化生产和应用[12]。本实验测定了平沙绿僵菌NJMp2103对双翅目淡色暗蚊幼虫，鳞翅目二化螟幼虫，半翅目中黑盲蝽初羽化成虫的毒力。其效果优良，是一株在实际生产中有巨大潜力的生防菌株。
1 材料与方法
1.1实验材料
本实验所使用的绿僵菌为从田间采回的病死僵虫中分离纯化得到的。
1．1．1 供试菌株的研究与培养
将采回的病死僵虫挑选后消毒后分解，放入盛有PDA的培养基中进行培养23d，观察其生长形态，从中挑选出不同部分菌落。对挑选菌落进行分离，避免挑到腐生真菌与细菌（腐生真菌一般不具备致死稻飞虱的毒力），挑选出的真菌在培养箱中培养23d后进一步纯化，直至每个培养皿中只有一种菌为止。
对分离培养出的真菌进行DNA鉴定，采用 CTAB法提真菌基因组DNA。首先取小块菌体，在100mL锥形瓶中摇菌，25℃，200r/min，大于24h。挑取适当大小的菌丝团过滤，用吸水纸压干后，放入匀浆器中，液氮研磨（加CTAB研磨）。将菌丝粉末置于2mL离心管中，加入2%CTAB提取液700—800μL，80μLSDS，涡旋混匀，于60℃水浴锅中水浴30min，期间每隔10min上下颠倒一次，混匀。加入等体积CIA氯仿/异戊醇（24:1），摇床上200r/min，20min。离心机中13000rpm，5min，吸(DNA在上清中)上清（约700μL），加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀。离心机13000rpm，5min，吸上清（约700μL），加等体积CIA，混匀。离心机13000rpm，5min，吸上清（约700μL），加2倍体积无水乙醇沉淀，20℃，30min以上。离心机13000rpm，5min，移除上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，吹干；加100μLdd水溶解沉淀，20μg/mL RNase（12μL），37℃消解大于20min后，20℃保存备用。使用ITS4ITS5引物对其进行PCR扩增，并获得其目的条带进行回收将回收的核算送于南京金斯瑞公司进行测序，在NCBI上进行Blast序列比对。
对分离纯化得到的真菌我们前期已进行相关的毒力测定，并证实其对某些昆虫具有较高的毒力，将其挑选出来后进行杀虫谱的测定。
1．1．2 供试昆虫
本实验的所有供试昆虫均为周边实验室提供的常年实验室室内饲养的敏感品系。本实验采用的供试昆虫有双翅目蚊科，鳞翅目二化螟，半翅目中黑盲蝽。
1．2 试验方法
培养供试真菌大量繁殖产孢，将吐温80溶液加入纯水配成0.05%的吐温80纯水溶液，用配好的0.05%的吐温80纯水溶液冲洗培养皿23次，将孢子从培养皿中洗下来，将孢子液转移至大离心管中，加入玻璃珠在涡旋混匀器上混匀，使孢子被充分打散后，用0.05%的吐温80纯水溶液按浓度梯度稀释,用血球计数板计算每毫升的真菌孢子含量，将其稀释成1×108孢子/mL。
双翅目淡色暗蚊以幼虫为供试虫体，在生测杯中加入70mL左右1×108孢子/mL的孢子液，后接入3040头幼虫，在培养箱中25℃光照16:8（光照：黑暗）条件下培养。每日统计死亡幼虫数，并在生物测定最后一天进行活虫数的统计。设置三组每组三个重复，并用0.05%吐温80纯水溶液饲养的淡色暗蚊幼虫作为对照组。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料2
1．1．1供试菌株的研究与培养2
1．1．2 供试昆虫3
1．2 试验方法3
2 结果与分析4
2．1 实验结果4
2．1．1 观察结果4
2．1．2 死亡率统计7
2．2 实验结论 7
3 讨论 7
3．1 实验结果讨论7
致谢8
参考文献9
平沙绿僵菌NJMp2103的杀虫谱测定
引言
引言:在害虫的生物防治中，虫生真菌扮演着重要角色，其中绿僵菌是一种重要的生防真菌，生防真菌的优点是对环境友好、普遍毒性较低、不易使病虫产生抗药性、不会发生农药富集现象等优点，是生产无公害农产品优选的农药品种，因此，真菌杀虫剂研究开发与应用核心特征是保持和维护环境的相容性,必须在满足人类健康和合理的生态平衡前提下,使有益生物获得有效保护,有害生物得到很好的抑制,来促进农业现代化向更高层次发展,尽可能维系生态环境的动态平衡[1]。已成为当前农药和植保界研究的热门课题，越来越受到全球的重视。绿僵菌是一种（Metarhizium anisopliae）广谱杀虫真菌，目前已经证实可以寄生多个目、多个科的不同种昆虫，还有害螨和线虫。已经有多个国家把绿僵菌应用于害虫防治。相比于传统的化学农药，绿僵菌对人、畜无毒性，作用范围广泛，寄主众多，致病力广泛，无残留，持效时间长。目前，昆虫病原真菌 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
已经被开发为微生物农药用于防治蚜虫、粉虱、叶蝉、螨类等[3]。在所有被开发出来的昆虫病原真菌中，由于绿僵菌寄主范围较广泛，能寄生 200 种以上害虫，并且已经被开发为各种农药制剂，二十世纪八十年代以来，国内外学者已经开始从自然界寻找对农业害虫有致病力的病原真菌，并且已经开始使用生物测定的办法测定昆虫病原真菌对昆虫的毒力，但是大多数真菌的防治效果比较有限[12]。 绿僵菌是当前世界上研究和应用最多的虫生真菌之一,借助绿僵菌对害虫进行生物防治具有非常广阔的前景。全球对绿僵菌的研究已有多年的历史,但由于受到许多因素的制约,导致其大田实际防效不稳定,极大地制约了其规模化生产和应用[12]。本实验测定了平沙绿僵菌NJMp2103对双翅目淡色暗蚊幼虫，鳞翅目二化螟幼虫，半翅目中黑盲蝽初羽化成虫的毒力。其效果优良，是一株在实际生产中有巨大潜力的生防菌株。
1 材料与方法
1.1实验材料
本实验所使用的绿僵菌为从田间采回的病死僵虫中分离纯化得到的。
1．1．1 供试菌株的研究与培养
将采回的病死僵虫挑选后消毒后分解，放入盛有PDA的培养基中进行培养23d，观察其生长形态，从中挑选出不同部分菌落。对挑选菌落进行分离，避免挑到腐生真菌与细菌（腐生真菌一般不具备致死稻飞虱的毒力），挑选出的真菌在培养箱中培养23d后进一步纯化，直至每个培养皿中只有一种菌为止。
对分离培养出的真菌进行DNA鉴定，采用 CTAB法提真菌基因组DNA。首先取小块菌体，在100mL锥形瓶中摇菌，25℃，200r/min，大于24h。挑取适当大小的菌丝团过滤，用吸水纸压干后，放入匀浆器中，液氮研磨（加CTAB研磨）。将菌丝粉末置于2mL离心管中，加入2%CTAB提取液700—800μL，80μLSDS，涡旋混匀，于60℃水浴锅中水浴30min，期间每隔10min上下颠倒一次，混匀。加入等体积CIA氯仿/异戊醇（24:1），摇床上200r/min，20min。离心机中13000rpm，5min，吸(DNA在上清中)上清（约700μL），加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀。离心机13000rpm，5min，吸上清（约700μL），加等体积CIA，混匀。离心机13000rpm，5min，吸上清（约700μL），加2倍体积无水乙醇沉淀，20℃，30min以上。离心机13000rpm，5min，移除上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，吹干；加100μLdd水溶解沉淀，20μg/mL RNase（12μL），37℃消解大于20min后，20℃保存备用。使用ITS4ITS5引物对其进行PCR扩增，并获得其目的条带进行回收将回收的核算送于南京金斯瑞公司进行测序，在NCBI上进行Blast序列比对。
对分离纯化得到的真菌我们前期已进行相关的毒力测定，并证实其对某些昆虫具有较高的毒力，将其挑选出来后进行杀虫谱的测定。
1．1．2 供试昆虫
本实验的所有供试昆虫均为周边实验室提供的常年实验室室内饲养的敏感品系。本实验采用的供试昆虫有双翅目蚊科，鳞翅目二化螟，半翅目中黑盲蝽。
1．2 试验方法
培养供试真菌大量繁殖产孢，将吐温80溶液加入纯水配成0.05%的吐温80纯水溶液，用配好的0.05%的吐温80纯水溶液冲洗培养皿23次，将孢子从培养皿中洗下来，将孢子液转移至大离心管中，加入玻璃珠在涡旋混匀器上混匀，使孢子被充分打散后，用0.05%的吐温80纯水溶液按浓度梯度稀释,用血球计数板计算每毫升的真菌孢子含量，将其稀释成1×108孢子/mL。
双翅目淡色暗蚊以幼虫为供试虫体，在生测杯中加入70mL左右1×108孢子/mL的孢子液，后接入3040头幼虫，在培养箱中25℃光照16:8（光照：黑暗）条件下培养。每日统计死亡幼虫数，并在生物测定最后一天进行活虫数的统计。设置三组每组三个重复，并用0.05%吐温80纯水溶液饲养的淡色暗蚊幼虫作为对照组。
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