灰飞虱谷胱甘肽s转移酶家族基因的克隆
谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases, GSTs)在生物体内是重要的二相解毒酶，是昆虫对杀虫剂产生代谢抗性的重要酶系。本实验利用灰飞虱转录组数据，通过本地BLAST挑选出19条可能的GST基因片段，并去除了2条冗余序列。在剩余的17条序列中9条是已发表的GST基因，另外8条是灰飞虱新GST基因。这8条新基因中2条GST的序列尚不完整，本文进一步利用RACE技术克隆获得其基因全长。最后把灰飞虱和其他昆虫的GST基因进行了同源比对和进化分析，为后续的灰飞虱GST介导的代谢抗性研究奠定了基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言： 1
1 材料与方法 2
1.1 供试昆虫 2
1.2 试虫饲养 2
1.3 试验试剂和实验设备 2
1.3.1供试分子试剂 2
1.3.2 供试仪器设备 3
1.4灰飞虱谷胱甘肽S转移酶基因的克隆 3
1.4.1 总RNA的提取 3
1.4.2 灰飞虱转录组GST基因片断的验证 3
1.4.3 灰飞虱LsGST7和LsGST8 的全长克隆 4
1.4.4 PCR反应体系及反应条件 4
1.4.5 目标PCR产物的回收纯化、连接转化及扩大培养 4
1.4.6 DNA序列分析 5
2结果与分析 5
2.1转录组谷胱甘肽S转移酶序列的验证 5
2.2 灰飞虱LsGST7和LsGST8基因的全长克隆 5
2.3灰飞虱谷胱甘肽S转移酶基因的进化分析 6
3. 讨论 8
致谢 8
参考文献 9
灰飞虱谷胱甘肽S转移酶家族基因的克隆
引言
引言：灰飞虱Laodelphax striatellus属半翅目，飞虱科，广泛分布于从菲律宾到西伯利亚一带的亚洲和欧洲的温带地区[1]。在我国，灰飞虱的分布以长江流域及北方稻区较多[2]。灰飞虱是褐飞虱、白背飞虱、灰飞虱中发生时间最早的一种，主 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
要为害早、中稻秧田和本田分蘖期的稻苗，具体表现为成、若虫刺吸水稻茎杆部位，吸食养分，影响植物的生长和发育，造成植株矮小，籽粒不饱满，禾苗逐渐枯萎直至死亡。近年发现，部分稻区水稻穗部受害也较为严重，当虫口密度大时，稻株因汁液大量丧失而导致穗部枯黄。灰飞虱的间接危害主要是作为多种病毒病害的媒介，传播病毒病。在华北和西北地区，灰飞虱主要传播小麦丛矮病和玉米粗缩病，在华东地区，则主要传播水稻条纹叶枯病和黑条矮缩病。灰飞虱传播病毒病危害所造成的损失远比直接刺吸危害大[3]。
在我国传统的农业生产中，灰飞虱并不是主要的害虫种群，可以在防治水稻褐飞虱、白背飞虱和小麦蚜虫的过程中通过化学防治得到较好的控制。然而，近年来，在长江中下游流域，随着现代耕作制度的改变，免耕、直播及套播等栽培技术的推广，宏观生态环境在改善的同时，使得灰飞虱虫源地滋生地得到保护，使得灰飞虱食料和栖息场所增多，为灰飞虱的连续发生创造了良好的条件，加重了灰飞虱的发生量。
近几年，灰飞虱发生危害的主要特点有：①越冬场所广、虫口基数特大；②带毒率较过去明显提高；③发育进度不整齐,世代重叠明显。一代和二代灰飞虱的致病力较强；④盛发危害时间长,水稻损失严重；⑤抗药性逐年增强[5]。目前，害虫抗药性机理主要涉及：害虫表皮穿透速率降低、对杀虫剂解毒代谢能力增强、杀虫剂靶标部位敏感性下降三个方面[6]。就灰飞虱而言，表皮穿透速率降低这一机制的研究比较少，尚无相关报道，因此，对灰飞虱的抗性机理研究主要涉及代谢抗性和靶标抗性。
在代谢抗性中，谷胱甘肽S转移酶(glutathion Stransferases,GSTs) 起着重要作用。GST是催化还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)与各种亲电子化合物进行亲核加成反应的一类酶[7]。它们在生物体内广泛地分布，而且几乎所有生物体内都有多种同工酶，每个同工酶都是由同源或异源的亚基组成的二聚体蛋白。GST的主要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基结合，形成更易溶解的、没有毒性的衍生物，同时使其易于排出体外或者被III相代谢酶类分解[8]。在生物体中，GST常发挥其脱毒与抗氧化的能力，以保护生物免受逆境的损害，使生物对杀虫剂解毒代谢能力增强，从而提高了生物的抗药性。GST通常分为三大类型，分别是微粒体型、线粒体型和胞质型。早期在昆虫中胞质型GST被分为Ⅰ、Ⅱ两大类[9]。在2010年，Chelvanayagam将哺乳动物胞质型GST分类和命名规则引入到昆虫中，将昆虫细胞质型GST分为Delta、Epsilon、Omega、Theta、Zeta和Sigma六个亚家族[10]。Delta和Epsilon亚家族是其他生物体所没有的，GST与杀虫剂抗药性的关系的大部分报道多集中这两个家族。虽然有详细和完善的分类，依然存在一些昆虫细胞质型GST无法归类到上述六类家族[11]，因此将其统称为未分类的GST (unclassified)[12]。
GST是昆虫对杀虫剂产生代谢抗性的重要酶系。本研究利用转录组数据，通过PCR克隆、同源比对和进化分析的方法，了解灰飞虱GST基因，为后续的灰飞虱GST介导的代谢抗性研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
供试昆虫灰飞虱，于2009年采自江苏建湖县，在未接触任何杀虫剂的情况下室内连续饲养。
1.2 试虫饲养
试虫饲养主要采用无土水稻育苗法。将水稻种子进行漂洗后催芽23天，把出芽后的种子均匀撒在饲养盒（35×18×18cm）中。把盒盖密封，等待稻种出苗。水稻苗长至35cm时，可将灰飞虱的成虫和若虫转移至盒内饲养，并用纱布覆盖封口。饲养盒每天均匀浇入适量的水，每10天左右更换水稻苗以保证灰飞虱的营养供给。灰飞虱饲养条件为：温度 25±1℃；光周期16L:8D；相对湿度5070%。
1.3 试验试剂和实验设备
1.3.1供试分子试剂
本实验作用主要试剂如下：美国Invitrogen公司生产的TRIzol? Reagent试剂盒；Clontech 公司生产的RACE试剂盒(SMARTER? RACE cDNA Amplification Kit)；Axygen公司生产的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒；北京全式金生物技术有限公司生产的pEASYT3 Cloning Kit、感受态细胞Trans1T1和DNA Marker；宝生物工程有限公司生产的MMLV反转录酶、Oligo(dT)18 Primer、 DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、6×Loading Buffer和DEPC处理水(RNase Free)等；南京金斯瑞生物科技有限公司合成了PCR所需引物并完成DNA测序工作。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言： 1
1 材料与方法 2
1.1 供试昆虫 2
1.2 试虫饲养 2
1.3 试验试剂和实验设备 2
1.3.1供试分子试剂 2
1.3.2 供试仪器设备 3
1.4灰飞虱谷胱甘肽S转移酶基因的克隆 3
1.4.1 总RNA的提取 3
1.4.2 灰飞虱转录组GST基因片断的验证 3
1.4.3 灰飞虱LsGST7和LsGST8 的全长克隆 4
1.4.4 PCR反应体系及反应条件 4
1.4.5 目标PCR产物的回收纯化、连接转化及扩大培养 4
1.4.6 DNA序列分析 5
2结果与分析 5
2.1转录组谷胱甘肽S转移酶序列的验证 5
2.2 灰飞虱LsGST7和LsGST8基因的全长克隆 5
2.3灰飞虱谷胱甘肽S转移酶基因的进化分析 6
3. 讨论 8
致谢 8
参考文献 9
灰飞虱谷胱甘肽S转移酶家族基因的克隆
引言
引言：灰飞虱Laodelphax striatellus属半翅目，飞虱科，广泛分布于从菲律宾到西伯利亚一带的亚洲和欧洲的温带地区[1]。在我国，灰飞虱的分布以长江流域及北方稻区较多[2]。灰飞虱是褐飞虱、白背飞虱、灰飞虱中发生时间最早的一种，主 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
要为害早、中稻秧田和本田分蘖期的稻苗，具体表现为成、若虫刺吸水稻茎杆部位，吸食养分，影响植物的生长和发育，造成植株矮小，籽粒不饱满，禾苗逐渐枯萎直至死亡。近年发现，部分稻区水稻穗部受害也较为严重，当虫口密度大时，稻株因汁液大量丧失而导致穗部枯黄。灰飞虱的间接危害主要是作为多种病毒病害的媒介，传播病毒病。在华北和西北地区，灰飞虱主要传播小麦丛矮病和玉米粗缩病，在华东地区，则主要传播水稻条纹叶枯病和黑条矮缩病。灰飞虱传播病毒病危害所造成的损失远比直接刺吸危害大[3]。
在我国传统的农业生产中，灰飞虱并不是主要的害虫种群，可以在防治水稻褐飞虱、白背飞虱和小麦蚜虫的过程中通过化学防治得到较好的控制。然而，近年来，在长江中下游流域，随着现代耕作制度的改变，免耕、直播及套播等栽培技术的推广，宏观生态环境在改善的同时，使得灰飞虱虫源地滋生地得到保护，使得灰飞虱食料和栖息场所增多，为灰飞虱的连续发生创造了良好的条件，加重了灰飞虱的发生量。
近几年，灰飞虱发生危害的主要特点有：①越冬场所广、虫口基数特大；②带毒率较过去明显提高；③发育进度不整齐,世代重叠明显。一代和二代灰飞虱的致病力较强；④盛发危害时间长,水稻损失严重；⑤抗药性逐年增强[5]。目前，害虫抗药性机理主要涉及：害虫表皮穿透速率降低、对杀虫剂解毒代谢能力增强、杀虫剂靶标部位敏感性下降三个方面[6]。就灰飞虱而言，表皮穿透速率降低这一机制的研究比较少，尚无相关报道，因此，对灰飞虱的抗性机理研究主要涉及代谢抗性和靶标抗性。
在代谢抗性中，谷胱甘肽S转移酶(glutathion Stransferases,GSTs) 起着重要作用。GST是催化还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)与各种亲电子化合物进行亲核加成反应的一类酶[7]。它们在生物体内广泛地分布，而且几乎所有生物体内都有多种同工酶，每个同工酶都是由同源或异源的亚基组成的二聚体蛋白。GST的主要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基结合，形成更易溶解的、没有毒性的衍生物，同时使其易于排出体外或者被III相代谢酶类分解[8]。在生物体中，GST常发挥其脱毒与抗氧化的能力，以保护生物免受逆境的损害，使生物对杀虫剂解毒代谢能力增强，从而提高了生物的抗药性。GST通常分为三大类型，分别是微粒体型、线粒体型和胞质型。早期在昆虫中胞质型GST被分为Ⅰ、Ⅱ两大类[9]。在2010年，Chelvanayagam将哺乳动物胞质型GST分类和命名规则引入到昆虫中，将昆虫细胞质型GST分为Delta、Epsilon、Omega、Theta、Zeta和Sigma六个亚家族[10]。Delta和Epsilon亚家族是其他生物体所没有的，GST与杀虫剂抗药性的关系的大部分报道多集中这两个家族。虽然有详细和完善的分类，依然存在一些昆虫细胞质型GST无法归类到上述六类家族[11]，因此将其统称为未分类的GST (unclassified)[12]。
GST是昆虫对杀虫剂产生代谢抗性的重要酶系。本研究利用转录组数据，通过PCR克隆、同源比对和进化分析的方法，了解灰飞虱GST基因，为后续的灰飞虱GST介导的代谢抗性研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
供试昆虫灰飞虱，于2009年采自江苏建湖县，在未接触任何杀虫剂的情况下室内连续饲养。
1.2 试虫饲养
试虫饲养主要采用无土水稻育苗法。将水稻种子进行漂洗后催芽23天，把出芽后的种子均匀撒在饲养盒（35×18×18cm）中。把盒盖密封，等待稻种出苗。水稻苗长至35cm时，可将灰飞虱的成虫和若虫转移至盒内饲养，并用纱布覆盖封口。饲养盒每天均匀浇入适量的水，每10天左右更换水稻苗以保证灰飞虱的营养供给。灰飞虱饲养条件为：温度 25±1℃；光周期16L:8D；相对湿度5070%。
1.3 试验试剂和实验设备
1.3.1供试分子试剂
本实验作用主要试剂如下：美国Invitrogen公司生产的TRIzol? Reagent试剂盒；Clontech 公司生产的RACE试剂盒(SMARTER? RACE cDNA Amplification Kit)；Axygen公司生产的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒；北京全式金生物技术有限公司生产的pEASYT3 Cloning Kit、感受态细胞Trans1T1和DNA Marker；宝生物工程有限公司生产的MMLV反转录酶、Oligo(dT)18 Primer、 DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、6×Loading Buffer和DEPC处理水(RNase Free)等；南京金斯瑞生物科技有限公司合成了PCR所需引物并完成DNA测序工作。
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