中华按蚊dna克隆的荧光原位杂交
疟疾是一种在世界各地均有发生的急性传染病，它严重危害着人类的健康。疟疾由疟疾原虫引起，并能通过雌性按蚊的叮咬在人群中广泛传播。中华按蚊是我国中部广大平原地区传播间日虐原虫的重要传播媒介，也是马来丝虫病的重要媒介之一。按蚊也是一种用于研究多线染色体的模式昆虫。荧光原位杂交技术作为一门新兴的分子标记技术，与传统的放射性标记原位杂交技术相比，具有快速、灵敏度高、检测信号强的特点，可以用于确定DNA或cDNA克隆在其染色体上的精确位置以及基因片段的方向性，为研究按蚊物理图谱的构建提供了技术支持。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1.材料与方法 3
1.1供试蚊虫和实验仪器 3
1.2实验方法 3
1.2.1解剖材料的制备 3
1.2.2多线染色体玻片的制备 3
1.3荧光探针的制备 4
1.3.1引物的设计 4
1.3.2中华按蚊基因组总DNA的提取 4
1.3.3目标DNA片段的回收 4
1.4目标片段的回收 5
1.5荧光探针的制作 6
1.6荧光探针与多线染色体杂交 6
1.6.1预杂交 6
1.6.2荧光原位杂交 6
1.6.3洗玻片 7
1.6.4信号的观察与定位 7
2.结果与分析 7
3.讨论 11
致谢 11
参考文献 11
中华按蚊DNA克隆的荧光原位杂交
植物保护学院学生 李璐
引言
疟疾（malaria）是由一种由疟原虫（Plasmodium）引起的，可以通过雌性按蚊（Anopheles）叮咬传播的全球性急性寄生虫传染病。它和艾滋病、结核病一起被世界卫生组织列为全球急需控制的三大公共卫生问题。根世界卫生组织估计，全世界每年有一亿以上的疟疾病例需要治疗。在蚊虫肆虐的热带地区，由于蚊虫的孳生不可能完全清除，疟疾的广泛传播成为了一个棘手的难题。据统计，非洲地区仅每年死于疟疾的14岁以 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
下儿童人数就超过了100万[1]。因为不同按蚊种群的防治方法不同，防治按蚊变得更加艰难。确定我国不同疟疾流行区域按蚊种群构成，在进行防治时根据种群类别选择不同的防治策略和技术方案，可以有效地提高按蚊防治效果。一般来说，依靠按蚊的外部形态特征来鉴定品种是最为简便的方法，但许多外部特征的描述都是较为模糊且主观性较强的，一些近似种在外部形态上也并不具有太大的区别——这些因素都容易造成鉴定的结果不准确。然而，按蚊具有结构特征明显的染色体，不同物种的按蚊体内的多线染色带型也不尽相同。通过荧光原位杂交技术建立高分辨率的多线染色体图谱和染色体物理图谱，能够对种群鉴定，特别是近似种或近缘种的鉴定起到积极地作用。在我国，中华按蚊是中部广大平原地区传播间日虐原虫的重要传播媒介，也是马来丝虫病的重要媒介之一。与此同时，中华按蚊也是研究多线染色体（polytene chromosome）的模式昆虫。多线染色体是在双翅目昆虫的某些细胞中存在的一种巨型染色体，由于它的巨大的形态，已被广泛地应用于生物的细胞遗传、分类、基因的定位和克隆及基因结构的研究[2]。荧光原位杂交是根据核酸碱基互补配对原则用半抗原标记DNA或者RNA探针与经过变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况[3]，可以用于确定DNA或cDNA克隆在其染色体上的精确位置以及基因片段的方向性，为中华按蚊物理图谱的构建提供了技术支持。
按蚊体细胞染色体共有三对。它的形成是由于某些细胞内，DNA多次复制但细胞未进行细胞分裂，复制过程中形成的大量子染色体紧密排列，并阻止了染色质的进一步包装，最终在细胞内形成了具有明暗相间条带的多线染色体。在按蚊的肠，唾液腺，马氏管和卵巢营养细胞中均有多线染色体的分布。X染色体、Y染色体以及两对常染色体。由于其本身的异染色质性质，按蚊的Y染色体无法形成多线染色体。将常染色体以其着丝粒为界进行划分，按蚊的多线染色体便被划分成了五条染色体臂：X、2L、2R、3L和3R[4]。我国对于按蚊基因组测序开始于20世纪80年代叶炳辉[4]等对于中华按蚊唾液染色体的研究。他对国外常用的模式图绘图方法进行了改进，因为模式图虽然较为清楚但是与实物相差较远，应用时容易产生不便，所以他利用普通油镜和相差油镜的拍摄图为基础，随后与标本相对照，尽量按着实际形态进行绘制。，随后缪建吾[5]的研究表明雷氏按蚊嗜人亚 种 与我国中华按蚊在常染色体方面有着很大的不同。后又有石焕焕等[6]对我国云南微小按蚊（An. minimus）的染色体进行了详细的研究，发现云南微小按蚊与广西微小按蚊有相似之处，多色染色体通常为5臂组成。宋锋林等利用利用探针标记、分子杂交 、序列分析等方法成功构建淡色库蚊的基因组文库,获取了8条微卫星序列, 为淡色库蚊基因定位 、种群遗传学、种群生态学等领域的研究提供新的分子遗传标记[7]。在国外方面最先由Coluzzi和Sabatini绘制了冈比亚按蚊复合体（Anopheles gambiae complex）的唾液腺多线染色体图谱，与此同时它也是目前基因组组装最完整的一个蚊种。随后也有很多相关研究，Zheng等用46个、57个和28个微卫星DNA作为遗传标志，构建了第一幅冈比亚按蚊的X染色体、2号染色体和3号染色体的低分辨率连锁遗传图谱，其对应的染色体长度分别为48.9cM, 72.4cM和93.7cM，分辨率分别为1.1cM ,1.2cM和3.2cM,平均分辨率为1.2cM。使得狄氏剂抗性、粉眼、白眼和红眼等多个基因位点得到确认，为冈比亚按蚊基因组的研究奠定了基础[8]。Cornel等将17个基因定位到了淡色按蚊（An. albimanus）的染色体上，构建了淡色按蚊的物理图谱[9] 并且研究了按蚊染色体臂的共线性关系。在按蚊中，缺少相应的物理图谱的库蚊属（Culex）和伊蚊属（Aedes）的蚊虫全基因组研究进展相对而言比较缓慢。库蚊属的致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）已知全基因组序列中只有38%定位到了染色体上[10]。在伊蚊属埃及伊蚊（Aedes agypti）基因组测序完成后，其基因组序列也仅有约31%被定位到了染色体上[11]。直到2013年，大约只有183 Mbp的序列被定位到埃及伊蚊的中期染色体上[12]。除了为基因组组装提供帮助外，2000年Ranson等在冈比亚按蚊上发现了一个与DDT抗药性相关的数量性状基因座，这与冈比亚按蚊染色体图谱和物理图谱的发表也有很大的关系[13]。但是由于按蚊基因组中多处重复序列，按蚊的基因组研究充满了挑战，Holt等人建立了比较完整的按蚊物理图谱[14]，随后Sharakhova等利用cDNA克隆原位杂交弥补了一些亚着丝粒区域的空白[15]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1.材料与方法 3
1.1供试蚊虫和实验仪器 3
1.2实验方法 3
1.2.1解剖材料的制备 3
1.2.2多线染色体玻片的制备 3
1.3荧光探针的制备 4
1.3.1引物的设计 4
1.3.2中华按蚊基因组总DNA的提取 4
1.3.3目标DNA片段的回收 4
1.4目标片段的回收 5
1.5荧光探针的制作 6
1.6荧光探针与多线染色体杂交 6
1.6.1预杂交 6
1.6.2荧光原位杂交 6
1.6.3洗玻片 7
1.6.4信号的观察与定位 7
2.结果与分析 7
3.讨论 11
致谢 11
参考文献 11
中华按蚊DNA克隆的荧光原位杂交
植物保护学院学生 李璐
引言
疟疾（malaria）是由一种由疟原虫（Plasmodium）引起的，可以通过雌性按蚊（Anopheles）叮咬传播的全球性急性寄生虫传染病。它和艾滋病、结核病一起被世界卫生组织列为全球急需控制的三大公共卫生问题。根世界卫生组织估计，全世界每年有一亿以上的疟疾病例需要治疗。在蚊虫肆虐的热带地区，由于蚊虫的孳生不可能完全清除，疟疾的广泛传播成为了一个棘手的难题。据统计，非洲地区仅每年死于疟疾的14岁以 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
下儿童人数就超过了100万[1]。因为不同按蚊种群的防治方法不同，防治按蚊变得更加艰难。确定我国不同疟疾流行区域按蚊种群构成，在进行防治时根据种群类别选择不同的防治策略和技术方案，可以有效地提高按蚊防治效果。一般来说，依靠按蚊的外部形态特征来鉴定品种是最为简便的方法，但许多外部特征的描述都是较为模糊且主观性较强的，一些近似种在外部形态上也并不具有太大的区别——这些因素都容易造成鉴定的结果不准确。然而，按蚊具有结构特征明显的染色体，不同物种的按蚊体内的多线染色带型也不尽相同。通过荧光原位杂交技术建立高分辨率的多线染色体图谱和染色体物理图谱，能够对种群鉴定，特别是近似种或近缘种的鉴定起到积极地作用。在我国，中华按蚊是中部广大平原地区传播间日虐原虫的重要传播媒介，也是马来丝虫病的重要媒介之一。与此同时，中华按蚊也是研究多线染色体（polytene chromosome）的模式昆虫。多线染色体是在双翅目昆虫的某些细胞中存在的一种巨型染色体，由于它的巨大的形态，已被广泛地应用于生物的细胞遗传、分类、基因的定位和克隆及基因结构的研究[2]。荧光原位杂交是根据核酸碱基互补配对原则用半抗原标记DNA或者RNA探针与经过变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况[3]，可以用于确定DNA或cDNA克隆在其染色体上的精确位置以及基因片段的方向性，为中华按蚊物理图谱的构建提供了技术支持。
按蚊体细胞染色体共有三对。它的形成是由于某些细胞内，DNA多次复制但细胞未进行细胞分裂，复制过程中形成的大量子染色体紧密排列，并阻止了染色质的进一步包装，最终在细胞内形成了具有明暗相间条带的多线染色体。在按蚊的肠，唾液腺，马氏管和卵巢营养细胞中均有多线染色体的分布。X染色体、Y染色体以及两对常染色体。由于其本身的异染色质性质，按蚊的Y染色体无法形成多线染色体。将常染色体以其着丝粒为界进行划分，按蚊的多线染色体便被划分成了五条染色体臂：X、2L、2R、3L和3R[4]。我国对于按蚊基因组测序开始于20世纪80年代叶炳辉[4]等对于中华按蚊唾液染色体的研究。他对国外常用的模式图绘图方法进行了改进，因为模式图虽然较为清楚但是与实物相差较远，应用时容易产生不便，所以他利用普通油镜和相差油镜的拍摄图为基础，随后与标本相对照，尽量按着实际形态进行绘制。，随后缪建吾[5]的研究表明雷氏按蚊嗜人亚 种 与我国中华按蚊在常染色体方面有着很大的不同。后又有石焕焕等[6]对我国云南微小按蚊（An. minimus）的染色体进行了详细的研究，发现云南微小按蚊与广西微小按蚊有相似之处，多色染色体通常为5臂组成。宋锋林等利用利用探针标记、分子杂交 、序列分析等方法成功构建淡色库蚊的基因组文库,获取了8条微卫星序列, 为淡色库蚊基因定位 、种群遗传学、种群生态学等领域的研究提供新的分子遗传标记[7]。在国外方面最先由Coluzzi和Sabatini绘制了冈比亚按蚊复合体（Anopheles gambiae complex）的唾液腺多线染色体图谱，与此同时它也是目前基因组组装最完整的一个蚊种。随后也有很多相关研究，Zheng等用46个、57个和28个微卫星DNA作为遗传标志，构建了第一幅冈比亚按蚊的X染色体、2号染色体和3号染色体的低分辨率连锁遗传图谱，其对应的染色体长度分别为48.9cM, 72.4cM和93.7cM，分辨率分别为1.1cM ,1.2cM和3.2cM,平均分辨率为1.2cM。使得狄氏剂抗性、粉眼、白眼和红眼等多个基因位点得到确认，为冈比亚按蚊基因组的研究奠定了基础[8]。Cornel等将17个基因定位到了淡色按蚊（An. albimanus）的染色体上，构建了淡色按蚊的物理图谱[9] 并且研究了按蚊染色体臂的共线性关系。在按蚊中，缺少相应的物理图谱的库蚊属（Culex）和伊蚊属（Aedes）的蚊虫全基因组研究进展相对而言比较缓慢。库蚊属的致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）已知全基因组序列中只有38%定位到了染色体上[10]。在伊蚊属埃及伊蚊（Aedes agypti）基因组测序完成后，其基因组序列也仅有约31%被定位到了染色体上[11]。直到2013年，大约只有183 Mbp的序列被定位到埃及伊蚊的中期染色体上[12]。除了为基因组组装提供帮助外，2000年Ranson等在冈比亚按蚊上发现了一个与DDT抗药性相关的数量性状基因座，这与冈比亚按蚊染色体图谱和物理图谱的发表也有很大的关系[13]。但是由于按蚊基因组中多处重复序列，按蚊的基因组研究充满了挑战，Holt等人建立了比较完整的按蚊物理图谱[14]，随后Sharakhova等利用cDNA克隆原位杂交弥补了一些亚着丝粒区域的空白[15]。
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