水稻黄单胞菌水稻致病变种转位子蛋白的鉴定
水稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）是水稻白叶枯病的致病菌，其可通过III型分泌系统（Type III secretion system， T3SS）将效应蛋白输送到宿主细胞中。转位子是T3SS的重要组分，由多组分蛋白复合体形成，对Xoo效应蛋白的转运起着关键作用。目前，黄单胞菌属中只有HrpF蛋白被鉴定为转位子蛋白，其他转位子蛋白的种类和作用机制还不清楚。本课题以鉴定HrpF的互作蛋白为主要目的，以期获得编码Xoo转位子蛋白的其他候选基因。首先我们考察了编码T3SS的hrp基因簇诱导表达时Xoo分泌的蛋白谱，鉴定出特异性分泌的Hrp蛋白HrpB1和Hpa4，考察HrpF与这两种蛋白是否存在互作关系。其次，我们构建了HrpFXoo过表达突变体，拟通过免疫共沉淀技术获得HrpF的互作蛋白。目前得到结果如下（1）HrpF与HrpB1、Hpa4不互作。（2）已完成HrpF在Xoo中的诱导表达，需要进一步通过免疫共沉淀寻找HrpF互作蛋白。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1. 供试菌株和质粒2
1.2 培养基2
1.3 试剂3
1.3.1 抗生素3
1.3.2 缓冲液4
1.3.3 染/脱色液4
1.3.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶4
1.3.5 酵母转化所用试剂4
1.3.6 引物5
1.4 仪器和设备5
1.5 方法5
1.5.1 目的基因的PCR扩增5
1.5.2 PCR产物胶回收6
1.5.3 酶切6
1.5.4 酶切产物纯化6
1.5.5 连接7
1.5.6 感受态的制备及转化7
1.5.7 质粒提取及验证8
1.5.8 蛋白诱导表达8
1.5.9 胞外蛋白提取9
1.5.10 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
1.5.11 Western Blot10
1.5.12 酵母双杂交10
1.5.13 免疫共沉淀实验（COIP）11
2 结果与分析11
2.1 PXO99A胞外蛋白提取结果11
2.2 利用酵母双杂交实验验证HrpB1、Hpa4与HrpF互作关系12
2.2.1 hrpB1、hpa4基因扩增12
2.2.2 重组质粒的构建12
2.2.3 酵母双杂交验证HrpF与HrpB1、Hpa4的相互关系12
2.3 免疫共沉淀寻找HrpF互作蛋白13 2.3.1 pMD19T::hrpF克隆载体的构建13
2.3.2 pMH1::hrpF表达载体的构建13
2.3.3 HrpF在Xoo PXO99A中诱导表达13
2.3.4 免疫共沉淀鉴别HrpF互作蛋白14
3 讨论14
致谢15
参考文献16
水稻黄单胞菌水稻致病变种转位子蛋白的鉴定
引言
水稻白叶枯病是水稻上最具破坏性的细菌性病害之一，对世界水稻生产造成严重的影响。其最早由日本于1884年发现，在亚洲及部分非洲地区尤为盛行，严重时可致水稻减产50%，是我国水稻三大病害之一[1]。
从分子水平上探究病原物的致病机理一直是水稻白叶枯病防治研究的热点。水稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）是白叶枯病的致病菌。其利用Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system，T3SS）将大量效应蛋白（type Ⅲ effectors）分泌到水稻细胞内引发病害[2]。T3SS是一种由细菌编码的毒力注射装置，连接细菌的外膜和寄主的细胞膜。注射器状的装置由至少20种蛋白质组成，主要包含一个锚钉于细菌内外膜上的多环型基座，伸向胞外的鞭毛状的附属结构和位于宿主细胞膜上的转位子[3]。多环型基座用于固定在细菌表面，胞外附属结构为输送效应蛋白的中心孔道[4]。转位子是T3SS的重要组分。当Xoo与宿主细胞接触时，T3SS分泌的转位子蛋白嵌于宿主细胞膜上形成孔状结构的转位子，与胞外附属结构对接，协助效应蛋白的转运[2]。
转位子通常由两种疏水性的转位子蛋白和一种亲水性的转位子蛋白组成[5]。在缺少外界分泌物的刺激时，三种蛋白分别与它们的分子伴侣结合以保持在细菌胞内的稳定性[5]。当病原菌与宿主细胞接触时，激活T3SS注射装置进行装配。一般认为转位子蛋白释放与其结合的分子伴侣，穿过胞外附属结构，一旦到达其最顶端，三种蛋白组分联合构成转位子。而三种转位子蛋白分泌到系统外是遵循怎样的顺序目前还未知。在组成转位子的三重机构中，亲水组分既不直接也不间接与靶标寄主细胞膜相连，而是在胞外附属结构的顶端形成一个独特的结构，极有可能是装配两种疏水组分的平台。两个携带疏水结构域的组分直接与靶标细胞膜相连，以低聚或单体的形式存在。目前所有T3SS研究中，最大的疏水转位子蛋白（the major translocator）（如Yersinia spp.中的YopB，Shigella spp.中的IpaB）有两个跨膜区，最小的疏水蛋白（the minor translocator）（如Yersinia spp.中的YopD，Shigella spp.中的IpaC）携带着单个跨膜区[5]。如果缺少了转位子蛋白，Xoo效应蛋白可以分泌但不能进入宿主细胞[6]。因此鉴定Xoo转位子蛋白的组成能为T3SS的致病机制和白叶枯病的防治提供一定依据，具有重要的科学意义。
黄单胞菌的T3SS由hrp（hypersensitive response and pathogenicity）基因簇编码，包括hrp基因、hrc（hrpconserved）基因、hpa（hrpassociated）基因以及调节基因[7]。hrp基因成簇分布于基因组上，称为hrp基因簇。hrpF基因是hrp基因簇中最大的基因（来自PXO99A的hrpFxoo基因为2409bp）[8]。hrpF位于hrp基因簇的右端，左边与hpaB基因相连。HrpF蛋白是目前公认的黄单胞菌T3SS转位子蛋白，被认为具有促进植物病原细菌效应蛋白转运的功能[9]。HrpF的N端信号肽用于感受分泌信号，可以调节分泌HrpF蛋白，其C端疏水部位则是HrpF的功能区[2]。研究显示：HrpF可以结合在寄主的细胞膜上，且辣椒细菌性斑点病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria，Xcv）中的HrpF蛋白可以在人工双分子脂膜上形成小孔[10]，说明在细菌与植物互作时HrpF可能作为转运工具协助蛋白的转运。同时，Xcv的hrpF缺失突变体（含有avrBs3基因）并不能在含有Bs3抗性基因的寄主上引起HR反应，表明HrpF蛋白在效应蛋白至宿主细胞的运输过程中扮演着重要角色[10]。
本课题围绕HrpF的互作蛋白进行研究，以期鉴定Xoo的转位子组成蛋白。实验室通过hrp诱导培养基诱导培养Xoo目的菌株，在其特异性表达的胞外蛋白中，我们筛选出可能编码与HrpF互作蛋白的hrp基因hpa4、hrpB1，以酵母双杂实验验证它们之间的相互关系；为了更全面地寻找其他的转位子蛋白，我们构建hrpF表达载体，诱导HrpF在目的菌株中大量表达，利用免疫共沉淀技术寻找HrpF互作蛋白，鉴别转位子蛋白。
1 材料与方法
1.1. 供试菌株和质粒
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1. 供试菌株和质粒2
1.2 培养基2
1.3 试剂3
1.3.1 抗生素3
1.3.2 缓冲液4
1.3.3 染/脱色液4
1.3.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶4
1.3.5 酵母转化所用试剂4
1.3.6 引物5
1.4 仪器和设备5
1.5 方法5
1.5.1 目的基因的PCR扩增5
1.5.2 PCR产物胶回收6
1.5.3 酶切6
1.5.4 酶切产物纯化6
1.5.5 连接7
1.5.6 感受态的制备及转化7
1.5.7 质粒提取及验证8
1.5.8 蛋白诱导表达8
1.5.9 胞外蛋白提取9
1.5.10 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
1.5.11 Western Blot10
1.5.12 酵母双杂交10
1.5.13 免疫共沉淀实验（COIP）11
2 结果与分析11
2.1 PXO99A胞外蛋白提取结果11
2.2 利用酵母双杂交实验验证HrpB1、Hpa4与HrpF互作关系12
2.2.1 hrpB1、hpa4基因扩增12
2.2.2 重组质粒的构建12
2.2.3 酵母双杂交验证HrpF与HrpB1、Hpa4的相互关系12
2.3 免疫共沉淀寻找HrpF互作蛋白13 2.3.1 pMD19T::hrpF克隆载体的构建13
2.3.2 pMH1::hrpF表达载体的构建13
2.3.3 HrpF在Xoo PXO99A中诱导表达13
2.3.4 免疫共沉淀鉴别HrpF互作蛋白14
3 讨论14
致谢15
参考文献16
水稻黄单胞菌水稻致病变种转位子蛋白的鉴定
引言
水稻白叶枯病是水稻上最具破坏性的细菌性病害之一，对世界水稻生产造成严重的影响。其最早由日本于1884年发现，在亚洲及部分非洲地区尤为盛行，严重时可致水稻减产50%，是我国水稻三大病害之一[1]。
从分子水平上探究病原物的致病机理一直是水稻白叶枯病防治研究的热点。水稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）是白叶枯病的致病菌。其利用Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system，T3SS）将大量效应蛋白（type Ⅲ effectors）分泌到水稻细胞内引发病害[2]。T3SS是一种由细菌编码的毒力注射装置，连接细菌的外膜和寄主的细胞膜。注射器状的装置由至少20种蛋白质组成，主要包含一个锚钉于细菌内外膜上的多环型基座，伸向胞外的鞭毛状的附属结构和位于宿主细胞膜上的转位子[3]。多环型基座用于固定在细菌表面，胞外附属结构为输送效应蛋白的中心孔道[4]。转位子是T3SS的重要组分。当Xoo与宿主细胞接触时，T3SS分泌的转位子蛋白嵌于宿主细胞膜上形成孔状结构的转位子，与胞外附属结构对接，协助效应蛋白的转运[2]。
转位子通常由两种疏水性的转位子蛋白和一种亲水性的转位子蛋白组成[5]。在缺少外界分泌物的刺激时，三种蛋白分别与它们的分子伴侣结合以保持在细菌胞内的稳定性[5]。当病原菌与宿主细胞接触时，激活T3SS注射装置进行装配。一般认为转位子蛋白释放与其结合的分子伴侣，穿过胞外附属结构，一旦到达其最顶端，三种蛋白组分联合构成转位子。而三种转位子蛋白分泌到系统外是遵循怎样的顺序目前还未知。在组成转位子的三重机构中，亲水组分既不直接也不间接与靶标寄主细胞膜相连，而是在胞外附属结构的顶端形成一个独特的结构，极有可能是装配两种疏水组分的平台。两个携带疏水结构域的组分直接与靶标细胞膜相连，以低聚或单体的形式存在。目前所有T3SS研究中，最大的疏水转位子蛋白（the major translocator）（如Yersinia spp.中的YopB，Shigella spp.中的IpaB）有两个跨膜区，最小的疏水蛋白（the minor translocator）（如Yersinia spp.中的YopD，Shigella spp.中的IpaC）携带着单个跨膜区[5]。如果缺少了转位子蛋白，Xoo效应蛋白可以分泌但不能进入宿主细胞[6]。因此鉴定Xoo转位子蛋白的组成能为T3SS的致病机制和白叶枯病的防治提供一定依据，具有重要的科学意义。
黄单胞菌的T3SS由hrp（hypersensitive response and pathogenicity）基因簇编码，包括hrp基因、hrc（hrpconserved）基因、hpa（hrpassociated）基因以及调节基因[7]。hrp基因成簇分布于基因组上，称为hrp基因簇。hrpF基因是hrp基因簇中最大的基因（来自PXO99A的hrpFxoo基因为2409bp）[8]。hrpF位于hrp基因簇的右端，左边与hpaB基因相连。HrpF蛋白是目前公认的黄单胞菌T3SS转位子蛋白，被认为具有促进植物病原细菌效应蛋白转运的功能[9]。HrpF的N端信号肽用于感受分泌信号，可以调节分泌HrpF蛋白，其C端疏水部位则是HrpF的功能区[2]。研究显示：HrpF可以结合在寄主的细胞膜上，且辣椒细菌性斑点病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria，Xcv）中的HrpF蛋白可以在人工双分子脂膜上形成小孔[10]，说明在细菌与植物互作时HrpF可能作为转运工具协助蛋白的转运。同时，Xcv的hrpF缺失突变体（含有avrBs3基因）并不能在含有Bs3抗性基因的寄主上引起HR反应，表明HrpF蛋白在效应蛋白至宿主细胞的运输过程中扮演着重要角色[10]。
本课题围绕HrpF的互作蛋白进行研究，以期鉴定Xoo的转位子组成蛋白。实验室通过hrp诱导培养基诱导培养Xoo目的菌株，在其特异性表达的胞外蛋白中，我们筛选出可能编码与HrpF互作蛋白的hrp基因hpa4、hrpB1，以酵母双杂实验验证它们之间的相互关系；为了更全面地寻找其他的转位子蛋白，我们构建hrpF表达载体，诱导HrpF在目的菌株中大量表达，利用免疫共沉淀技术寻找HrpF互作蛋白，鉴别转位子蛋白。
1 材料与方法
1.1. 供试菌株和质粒
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