转灰飞虱cyp353d1v2基因果蝇的生物测定
灰飞虱是危害水稻的重要害虫。近年来由于其发生量的增加,灰飞虱抗药性不断发展。细胞色素P450(简称P450)对杀虫剂代谢作用的增强是昆虫产生抗药性的重要机制。因此，本实验通过点滴法测定了转灰飞虱CYP353D1v2基因果蝇品系对乙虫腈、毒死蜱、灭多威、氟虫腈、阿维菌素、溴氰菊酯和吡虫啉的敏感性，解析灰飞虱CYP353D1v2基因在代谢杀虫剂中的作用，明确灰飞虱代谢抗性机制，为灰飞虱抗性的监测和有效治理提供理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言12
1材料与方法1
1.1材料1
1.2方法2
2结果与分析39
2.1转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对乙虫腈的敏感性3
2.2转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对溴氰菊酯的敏感性4
2.3 转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对阿维菌素的敏感性4
2.4转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对灭多威的敏感性5
2.5转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对氟虫腈的敏感性6
2.6转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对吡虫啉的敏感性 7
2.7转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对毒死蜱的敏感性 8
3小结与讨论9
致谢
参考文献
转灰飞虱CYP353D1v2基因果蝇的生物测定
引言
引言：灰飞虱是危害水稻的重要害虫，分布遍及全国各地，以长江流域和北方稻区发生较多。灰飞虱的内禀增长率值较大，环境容量值较小，种群数量多处于不稳定状态，对环境的适应恢复力较强，世代周期短。在我国，灰飞虱一年可发生38代，发生代数随不同地区而异，吉林一年发生34代，华北地区45代，长江中下游地区56代。华南稻区78代。
在我国传统的农业生产中，灰飞虱并不是主要的害虫。虽然能够取食刺吸为害水稻、小麦、大麦、玉米、高梁、甘蔗、看麦娘、稗草等多种禾本科植物，但是可在防治水稻褐飞虱、白背飞虱和小麦蚜虫的过程中得到较好的兼治[1]。然而，自2000年以来，灰飞虱传播的水稻条纹叶枯病在江淮地区日益严重，成为江苏省19 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
99年来最严重的水稻病害之一，年均发病都超过60万亩。20002003年，生产上每年都出现发病率在50%以上甚至绝收的重病田[2]。2004年，出现了5、6代灰飞虱发生量特高并聚集于水稻穗部取食，造成稻穗发黑发霉，严重影响水稻灌浆结实的现象，甚至部分田块因条纹叶枯病而绝收[3]。因此，灰飞虱传毒所产生的危害远大于其直接取食。
目前，对灰飞虱传播的病毒病尚无很好的防治方法。因此，只能通过防虫来防病。由于长期大面积，不合理的使用化学农药，灰飞虱对各种杀虫剂产生了抗药性。例如，Kimura对灰飞虱的抗性监测发现，六六六在日本使用十几年后，灰飞虱便对六六六产生了抗药性[4]。80 年代, 又陆续监测到灰飞虱对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂产生了抗药性[5]。90年代，Sone等采用点滴法监测了日本9个灰飞虱种群的抗药性，其研究结果表明绝大多数种群对醚菊酯和吡虫啉相对敏感，但对乙拌磷和残杀威分别产生了548倍和10360倍的抗药性[6]。在我国，张晓婕等在2005年对浙江省湖州、宁波和嘉兴地区的灰飞虱进行了常用农药吡虫啉、毒死蜱和锐劲特的抗药性监测。结果表明,吡虫啉在浙江省的使用范围较广, 时间较长, 灰飞虱已经产生一定抗性，而锐劲特和毒死蜱抗性水平较低[7]。2008年，高保立等报道来自中国江苏的3个灰飞虱种群对吡虫啉产生了60到108倍的高水平抗性, 福建和广东灰飞虱种群对吡虫啉也产生了中等水平的抗性[8]。
已有的研究报道表明：昆虫细胞色素P450(简称P450)对杀虫剂代谢作用的增强是昆虫产生抗药性的重要机制（Scott et al., 2001；Liu et al, 2015）。P450通过过量表达和增强活性可有效地催化杀虫剂的代谢和降解，发挥解毒代谢的作用。但是上述研究大都停留在P450酶过量表达与代谢抗性相关性的描述上，尚未做深入的功能研究。
果蝇（Drosophila melanogaster）作为重要的模式生物，由于其遗传操作很方便，被应用昆虫的抗药性机制的研究中。例如，Zhu等将赤拟谷盗（Tribolium castaneum）CYP6BQ9基因导入果蝇体内进行超量表达，验证了CYP6BQ9 对溴氰菊酯的代谢作用；Riveron 等[9]分别将埃及按蚊（Anopheles funestus）CYP6P9a和CYP6P9b基因在果蝇中进行了过量表达，证实了这两个基因对苄氯菊酯和溴氰菊酯的代谢作用；Edi等将冈比亚按蚊（A. gambiae）CYP6M2和CYP6P3转入果蝇中过量表达，通过生物测定分析了其对苄氯菊酯、溴氰菊酯和恶虫威的抗药性。因此，可以利用转基因技术，将昆虫中抗药性相关的解毒酶基因在果蝇体内进行超量表达，通过农药的生物测定技术来揭示该解毒酶与杀虫剂代谢的关系，从而有助于深入探索杀虫剂抗药性机理。
因此，本文在前期获得转灰飞虱CYP353D1v2果蝇品系并验证了目标基因在果蝇中超量表达的基础上（见朱昱璇硕士学位论文），对该品系进行药剂的敏感性测定，研究CYP353D1v2基因在灰飞虱体内的解毒代谢作用，研究结果对灰飞虱抗性的监测和治理具有重要的意义。
1 材料与方法
供试昆虫
供试果蝇用由玉米粉、酵母粉、白糖和琼脂做成的人工饲料饲养，实验室饲养条件光周期L : D = 14 : 10，温度（25±2）℃，湿度 60 % 70 %。
供试药剂
98.5%溴氰菊酯原药，拜耳作物科学有限公司生产；
97%吡虫啉原药，由南京红太阳集团生产；
96.5%毒死蜱原药，由南京红太阳集团生产；
95%氟虫腈原药，由浙江新农化工股份有限公司生产；
92%阿维菌素原药，由江苏丰源化工生产；
97.5%灭多威原药，由江苏省常隆化工有限公司生产；
97.4%乙虫腈原药，由南京红太阳集团生产。
1．3 方法
实验果蝇孵化为成虫后，选择羽化后4天的雌性果蝇，用二氧化碳麻醉，然后用手动微量点滴器（使用体积为0.040μL）将药液点滴在试虫的前胸背板的正中间。每种药剂用丙酮稀释成56个浓度，每浓度处理20头，重复3次，用丙酮做为对照。点滴农药后的果蝇放在新鲜培养基瓶中，培养条件同上。农药处理48 h后，查看并准确记录实验果蝇的死亡数量。本实验中我们采用果蝇留足抽搐或者果蝇静止但腹部朝上都作为果蝇死亡的标准。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言12
1材料与方法1
1.1材料1
1.2方法2
2结果与分析39
2.1转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对乙虫腈的敏感性3
2.2转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对溴氰菊酯的敏感性4
2.3 转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对阿维菌素的敏感性4
2.4转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对灭多威的敏感性5
2.5转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对氟虫腈的敏感性6
2.6转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对吡虫啉的敏感性 7
2.7转灰飞虱CYP353D1v2果蝇对毒死蜱的敏感性 8
3小结与讨论9
致谢
参考文献
转灰飞虱CYP353D1v2基因果蝇的生物测定
引言
引言：灰飞虱是危害水稻的重要害虫，分布遍及全国各地，以长江流域和北方稻区发生较多。灰飞虱的内禀增长率值较大，环境容量值较小，种群数量多处于不稳定状态，对环境的适应恢复力较强，世代周期短。在我国，灰飞虱一年可发生38代，发生代数随不同地区而异，吉林一年发生34代，华北地区45代，长江中下游地区56代。华南稻区78代。
在我国传统的农业生产中，灰飞虱并不是主要的害虫。虽然能够取食刺吸为害水稻、小麦、大麦、玉米、高梁、甘蔗、看麦娘、稗草等多种禾本科植物，但是可在防治水稻褐飞虱、白背飞虱和小麦蚜虫的过程中得到较好的兼治[1]。然而，自2000年以来，灰飞虱传播的水稻条纹叶枯病在江淮地区日益严重，成为江苏省19 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
99年来最严重的水稻病害之一，年均发病都超过60万亩。20002003年，生产上每年都出现发病率在50%以上甚至绝收的重病田[2]。2004年，出现了5、6代灰飞虱发生量特高并聚集于水稻穗部取食，造成稻穗发黑发霉，严重影响水稻灌浆结实的现象，甚至部分田块因条纹叶枯病而绝收[3]。因此，灰飞虱传毒所产生的危害远大于其直接取食。
目前，对灰飞虱传播的病毒病尚无很好的防治方法。因此，只能通过防虫来防病。由于长期大面积，不合理的使用化学农药，灰飞虱对各种杀虫剂产生了抗药性。例如，Kimura对灰飞虱的抗性监测发现，六六六在日本使用十几年后，灰飞虱便对六六六产生了抗药性[4]。80 年代, 又陆续监测到灰飞虱对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂产生了抗药性[5]。90年代，Sone等采用点滴法监测了日本9个灰飞虱种群的抗药性，其研究结果表明绝大多数种群对醚菊酯和吡虫啉相对敏感，但对乙拌磷和残杀威分别产生了548倍和10360倍的抗药性[6]。在我国，张晓婕等在2005年对浙江省湖州、宁波和嘉兴地区的灰飞虱进行了常用农药吡虫啉、毒死蜱和锐劲特的抗药性监测。结果表明,吡虫啉在浙江省的使用范围较广, 时间较长, 灰飞虱已经产生一定抗性，而锐劲特和毒死蜱抗性水平较低[7]。2008年，高保立等报道来自中国江苏的3个灰飞虱种群对吡虫啉产生了60到108倍的高水平抗性, 福建和广东灰飞虱种群对吡虫啉也产生了中等水平的抗性[8]。
已有的研究报道表明：昆虫细胞色素P450(简称P450)对杀虫剂代谢作用的增强是昆虫产生抗药性的重要机制（Scott et al., 2001；Liu et al, 2015）。P450通过过量表达和增强活性可有效地催化杀虫剂的代谢和降解，发挥解毒代谢的作用。但是上述研究大都停留在P450酶过量表达与代谢抗性相关性的描述上，尚未做深入的功能研究。
果蝇（Drosophila melanogaster）作为重要的模式生物，由于其遗传操作很方便，被应用昆虫的抗药性机制的研究中。例如，Zhu等将赤拟谷盗（Tribolium castaneum）CYP6BQ9基因导入果蝇体内进行超量表达，验证了CYP6BQ9 对溴氰菊酯的代谢作用；Riveron 等[9]分别将埃及按蚊（Anopheles funestus）CYP6P9a和CYP6P9b基因在果蝇中进行了过量表达，证实了这两个基因对苄氯菊酯和溴氰菊酯的代谢作用；Edi等将冈比亚按蚊（A. gambiae）CYP6M2和CYP6P3转入果蝇中过量表达，通过生物测定分析了其对苄氯菊酯、溴氰菊酯和恶虫威的抗药性。因此，可以利用转基因技术，将昆虫中抗药性相关的解毒酶基因在果蝇体内进行超量表达，通过农药的生物测定技术来揭示该解毒酶与杀虫剂代谢的关系，从而有助于深入探索杀虫剂抗药性机理。
因此，本文在前期获得转灰飞虱CYP353D1v2果蝇品系并验证了目标基因在果蝇中超量表达的基础上（见朱昱璇硕士学位论文），对该品系进行药剂的敏感性测定，研究CYP353D1v2基因在灰飞虱体内的解毒代谢作用，研究结果对灰飞虱抗性的监测和治理具有重要的意义。
1 材料与方法
供试昆虫
供试果蝇用由玉米粉、酵母粉、白糖和琼脂做成的人工饲料饲养，实验室饲养条件光周期L : D = 14 : 10，温度（25±2）℃，湿度 60 % 70 %。
供试药剂
98.5%溴氰菊酯原药，拜耳作物科学有限公司生产；
97%吡虫啉原药，由南京红太阳集团生产；
96.5%毒死蜱原药，由南京红太阳集团生产；
95%氟虫腈原药，由浙江新农化工股份有限公司生产；
92%阿维菌素原药，由江苏丰源化工生产；
97.5%灭多威原药，由江苏省常隆化工有限公司生产；
97.4%乙虫腈原药，由南京红太阳集团生产。
1．3 方法
实验果蝇孵化为成虫后，选择羽化后4天的雌性果蝇，用二氧化碳麻醉，然后用手动微量点滴器（使用体积为0.040μL）将药液点滴在试虫的前胸背板的正中间。每种药剂用丙酮稀释成56个浓度，每浓度处理20头，重复3次，用丙酮做为对照。点滴农药后的果蝇放在新鲜培养基瓶中，培养条件同上。农药处理48 h后，查看并准确记录实验果蝇的死亡数量。本实验中我们采用果蝇留足抽搐或者果蝇静止但腹部朝上都作为果蝇死亡的标准。
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