泰山叶刺瘿螨线粒体基因组研究
瘿螨是农林业螨类中体型最小的类群，主要通过刺吸为害寄主植物。线粒体基因组具有分子量相对较小、呈母系遗传、突变率高以及在细胞中拷贝多等特点。国内外近年来对于昆虫线粒体基因组的研究主要集中于通过比较线粒体基因片段来进行昆虫的系统发育规律的研究。而线粒体全基因组不仅比单个线粒体基因包含更多的序列信息，而且具有一系列基因组水平的特征，如基因排序、RNA 基因的二级结构以及复制和转录的控制模式等。本文测定了泰山叶刺瘿螨Phyllocoptes taishanensis (Xue & Hong，2005)全线粒体基因组，探寻最适于研究瘿螨系统发育的方法。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1□材料与方法4
1.1□材料 4
1.1.1□材料的野外采集及预处理4
1.1.2□材料的室内处理4
1.2□方法 4
1.2.1□总DNA的提取4
1.2.2□引物设计4
1.2.3□PCR扩增5
1.2.4□测序5
1.2.5□序列拼接及注释5
2□结果与分析5
2.1□16S和COI片段的测序结果5
2.2□相应补全短长片段PCR结果5
2.3□当前实验结果分析5
3□结论6
3.1□全DNA提取方法6
3.2□凝胶电泳结果不理想的原因排除7
3.3□瘿螨线粒体基因组测序问题讨论7
致谢7
参考文献5
泰山叶刺瘿螨线粒体基因组研究
引言
线粒体是真核生物细胞提供能量的细胞器，其显著特点是具有自身的DNA和遗传体系。由于线粒体基因组具有分子量相对较小、呈母系遗传、突变率高以及在细胞中拷贝多等特点，近年来被广泛用于种群遗传学、谱系地理学、分子进化、种系发生和比较及进化基因组学等多方面的研究，测序数据有助于加深人们对物种进化现象、过程及机制的理解[1]。
瘿螨总科Eriophyoidea属于蛛形纲Arachnida、蜱螨亚纲Acari、真螨总科 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
Acariformes、前气门目Prostimnata、四足螨股Tetrapodilina。瘿螨是农林业螨类中体型最小的类群，一般体长为160280微米，宽4080微米，多为纺锤形和蠕虫形，少数为锥形或楔形。瘿螨主要通过刺吸为害寄主植物，发生量小时对寄主植物不会造成太大危害，但当种群数量很大时，会影响寄主植物的光合作用，影响作物品质；同时部分种类也是多种植物病原病毒的传播媒介。国内外尚无瘿螨总科线粒体基因组的研究，早期研究分子生物学研究大多集中于通过比较线粒体基因片段来进行瘿螨的系统发育规律的研究[2]。而线粒体全基因组不仅比单个线粒体基因包含更多的序列信息，而且具有一系列基因组水平的特征，如基因排序、RNA 基因的二级结构以及复制和转录的控制模式等。目前国内外已有对蜱螨亚纲线粒体基因组的研究，已有46种蜱螨完成了全线粒体基因组测序工作，但瘿螨总科的线粒体基因组测定仍是一片空白[3]。
泰山叶刺瘿螨Phyllocoptes taishanensis (Xue & Hong，2005)属于瘿螨总科中瘿螨科Eriophyidae Nalepa、叶刺瘿螨族Phyllocoptini Nalepa、叶刺瘿螨属Phyllocoptes Nalepa[4]。本课题以泰山叶刺瘿螨为研究标本，参考国内外蜱螨线粒体全基因组研究技术的并进行完善，测定了泰山叶刺瘿螨近全线粒体基因。研究结果为今后的瘿螨全线粒体基因组测序起到奠基作用，并为今后线粒体基因组序列在瘿螨总科系统发育分析中的应用提供基础数据。
1 材料与方法
1．1 材料
研究使用的泰山叶刺瘿螨样品于2013年6月采自江苏省南京市中山陵雪松，样品保存于大学植物保护学院昆虫分子与生态实验室。
1．1．1 材料的野外采集及预处理
户外采集时采取雪松针叶，拔掉叶鞘，使用手持放大镜初步观察是否存在瘿螨以及发生量，选取瘿螨发生量较大的松叶进行采集并记录[5]。将收集的松叶去掉叶鞘并用100%的酒精浸泡（主要浸泡近叶鞘部分），密封玻璃管，常温保存备用[6]。
1．1．2 材料的室内处理
将酒精浸泡液倒入玻璃培养皿中，在体式显微镜下进行观察，挑取成虫制作玻片进行形态学鉴定，确认为泰山叶刺瘿螨后挑取100200头螨虫浸泡于适量100%酒精中，常温储存备用。
1．2 方法
1．2．1 总DNA的提取
泰山叶刺瘿螨基因组DNA采用QIAGEN Dneasy Blood & Tissue Kit试剂盒提取。
提取过程：将酒精浸泡液中的酒精挥发干净，瘿螨样品加入180μl ATL在56℃水浴中 450rpm震荡过夜，第二天加蛋白酶K（试剂盒）20μl进行孵化，同一条件下水浴震荡72 h。加入AL缓冲液200μl，颠倒混合，放入56℃水浴至完全溶解。加无水乙醇200μl，充分摇晃溶解至油状物变澄清，放至常温。将全部液体转移到柱子上，放置一会儿后8000 rpm离心1 min。弃掉含液提的收集管换上新的，加AW1 500μl，放置一会儿后，8000rpm离心1min，换收集管，加500μl AW2充分反应后14000rpm离心3min，重复一遍。换收集管，常温放置一会儿至柱子中酒精完全挥发。加AE洗脱液100μl，反应5min以上，8000rpm离心1min，将液体吸回柱子，重复一次（使DNA回收率提高）。20℃保存备用。
1．2．2 引物设计方法
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1□材料与方法4
1.1□材料 4
1.1.1□材料的野外采集及预处理4
1.1.2□材料的室内处理4
1.2□方法 4
1.2.1□总DNA的提取4
1.2.2□引物设计4
1.2.3□PCR扩增5
1.2.4□测序5
1.2.5□序列拼接及注释5
2□结果与分析5
2.1□16S和COI片段的测序结果5
2.2□相应补全短长片段PCR结果5
2.3□当前实验结果分析5
3□结论6
3.1□全DNA提取方法6
3.2□凝胶电泳结果不理想的原因排除7
3.3□瘿螨线粒体基因组测序问题讨论7
致谢7
参考文献5
泰山叶刺瘿螨线粒体基因组研究
引言
线粒体是真核生物细胞提供能量的细胞器，其显著特点是具有自身的DNA和遗传体系。由于线粒体基因组具有分子量相对较小、呈母系遗传、突变率高以及在细胞中拷贝多等特点，近年来被广泛用于种群遗传学、谱系地理学、分子进化、种系发生和比较及进化基因组学等多方面的研究，测序数据有助于加深人们对物种进化现象、过程及机制的理解[1]。
瘿螨总科Eriophyoidea属于蛛形纲Arachnida、蜱螨亚纲Acari、真螨总科 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
Acariformes、前气门目Prostimnata、四足螨股Tetrapodilina。瘿螨是农林业螨类中体型最小的类群，一般体长为160280微米，宽4080微米，多为纺锤形和蠕虫形，少数为锥形或楔形。瘿螨主要通过刺吸为害寄主植物，发生量小时对寄主植物不会造成太大危害，但当种群数量很大时，会影响寄主植物的光合作用，影响作物品质；同时部分种类也是多种植物病原病毒的传播媒介。国内外尚无瘿螨总科线粒体基因组的研究，早期研究分子生物学研究大多集中于通过比较线粒体基因片段来进行瘿螨的系统发育规律的研究[2]。而线粒体全基因组不仅比单个线粒体基因包含更多的序列信息，而且具有一系列基因组水平的特征，如基因排序、RNA 基因的二级结构以及复制和转录的控制模式等。目前国内外已有对蜱螨亚纲线粒体基因组的研究，已有46种蜱螨完成了全线粒体基因组测序工作，但瘿螨总科的线粒体基因组测定仍是一片空白[3]。
泰山叶刺瘿螨Phyllocoptes taishanensis (Xue & Hong，2005)属于瘿螨总科中瘿螨科Eriophyidae Nalepa、叶刺瘿螨族Phyllocoptini Nalepa、叶刺瘿螨属Phyllocoptes Nalepa[4]。本课题以泰山叶刺瘿螨为研究标本，参考国内外蜱螨线粒体全基因组研究技术的并进行完善，测定了泰山叶刺瘿螨近全线粒体基因。研究结果为今后的瘿螨全线粒体基因组测序起到奠基作用，并为今后线粒体基因组序列在瘿螨总科系统发育分析中的应用提供基础数据。
1 材料与方法
1．1 材料
研究使用的泰山叶刺瘿螨样品于2013年6月采自江苏省南京市中山陵雪松，样品保存于大学植物保护学院昆虫分子与生态实验室。
1．1．1 材料的野外采集及预处理
户外采集时采取雪松针叶，拔掉叶鞘，使用手持放大镜初步观察是否存在瘿螨以及发生量，选取瘿螨发生量较大的松叶进行采集并记录[5]。将收集的松叶去掉叶鞘并用100%的酒精浸泡（主要浸泡近叶鞘部分），密封玻璃管，常温保存备用[6]。
1．1．2 材料的室内处理
将酒精浸泡液倒入玻璃培养皿中，在体式显微镜下进行观察，挑取成虫制作玻片进行形态学鉴定，确认为泰山叶刺瘿螨后挑取100200头螨虫浸泡于适量100%酒精中，常温储存备用。
1．2 方法
1．2．1 总DNA的提取
泰山叶刺瘿螨基因组DNA采用QIAGEN Dneasy Blood & Tissue Kit试剂盒提取。
提取过程：将酒精浸泡液中的酒精挥发干净，瘿螨样品加入180μl ATL在56℃水浴中 450rpm震荡过夜，第二天加蛋白酶K（试剂盒）20μl进行孵化，同一条件下水浴震荡72 h。加入AL缓冲液200μl，颠倒混合，放入56℃水浴至完全溶解。加无水乙醇200μl，充分摇晃溶解至油状物变澄清，放至常温。将全部液体转移到柱子上，放置一会儿后8000 rpm离心1 min。弃掉含液提的收集管换上新的，加AW1 500μl，放置一会儿后，8000rpm离心1min，换收集管，加500μl AW2充分反应后14000rpm离心3min，重复一遍。换收集管，常温放置一会儿至柱子中酒精完全挥发。加AE洗脱液100μl，反应5min以上，8000rpm离心1min，将液体吸回柱子，重复一次（使DNA回收率提高）。20℃保存备用。
1．2．2 引物设计方法
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