禾谷镰孢菌β2微管蛋白的荧关蛋白标记与应用
1本研究通过基因重组与禾谷镰孢菌转化技术获得了绿色荧光蛋白基因与2种禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因融合突变题菌株。研究表明禾谷镰孢菌荧光蛋白标记的β2-微管蛋白基因可以同源替换内源的同一β2-微管蛋白基因，并能正常表达，对目标蛋白的生物学功能没有影响，且不影响该菌的菌丝生长，有性繁殖，无性繁殖。利用上述GFP融合菌株观察多菌灵的作用。结果表明多菌灵作用机制是影响微管的作用，进一步影响病原菌的有丝分裂。因此禾谷镰孢菌田间多菌灵抗性是由于β2-微管蛋白基因突变引起的。
目录
引言
小麦赤霉病是一种分布很广的病害，全世界几乎所有的小麦产区都有该病发生。在我国，小麦赤霉病在中国小麦栽培地区都有发布，其中主要发生在长江中下游的冬麦区和东北的春麦区。
根据国内外报道，大约有20个种或变种的镰孢属真菌能引起小麦赤霉病，除禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）外，还有串珠镰孢菌（F. moniliforme Sheld）、黄色镰孢菌（F. culmorum）、燕麦镰孢菌（F. avenaceum）等。在我国引起小麦赤霄病的病原菌主要为禾谷镰孢菌。1976~1980年全国小麦赤霉病研究协作组鉴定了各麦区的2450份赤霉病穗标样，其中禾谷镰孢菌占总样品的94.5%。但近年来借助分子生物学手段发现一个引起小麦赤霉病的新种F. asiaticum。由于该种在生物学特性方面与难以区分，我国植物病理学者一直将其与作为同一个种进行研究，实际上我国在长江中下游地区是由这两种镰孢属真菌侵染小麦引起小麦赤霉病[1]。
禾谷镰孢菌不仅侵染小麦，而且还侵染大麦、燕麦、玉米等多种禾谷类作物。小麦从苗期到成株期均可遭受禾谷镰孢菌的侵染，分别引起苗腐、基腐、茎腐和穗腐。在中国的大部分地区，通常以穗腐危害损失最大，其次为苗腐。赤霉病的小麦生产的影响除造成减外，更主要的是该病菌分泌的毒素对麦粒的污染，人畜取食一定量的麦粒后会引起中毒，病粒达20%时，小麦便失去了食用和商品价值。小麦赤霉病的发生受气候和播种期等因素的影响较大，因此在不同年份发病不一。
苯并咪唑类杀菌剂是20世纪年代60末、70年代初开发的一类含有苯并咪唑分子结构的高效、广谱内吸性杀菌剂,这类药剂的成功开发和推广应用,被认为是世纪植物病害化学防治中最重要的事 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
件,标志着植物病害化学防治从此进入一个新的历史阶段。苯并咪喃类药剂中最大的一类为农用杀菌剂，对大多数子囊菌、半子菌和担子菌引起的病害均有防治效果，对半知菌中的链格孢属、轮枝菌属无效,对鞭毛菌亚门真菌和细菌引起的病害也没有防治效果。又因为该类药剂被首先发现具有植物内吸性，对病害具有治疗作用，该类杀菌剂主要作用于病原菌的微管蛋白，阻止纺锤丝的形成，从而干扰细胞核的分裂。因此这类药剂作用位点单一，选择性较强，病原菌在药剂选择压力下很容易产生抗药性，而且在高剂量压力下,病原菌抗药性群体很容易发生流行,最终导致防治失败[1]。
自从苯并咪唑类杀菌剂被作为控制许多危害性病原菌的最有效方式而被广泛应用以来,抗药性不可避免地成为植物保护过程中的一个重要问题。这类药剂在20世纪60年代后期问世，在1969年，就首次报道了黄瓜白粉病菌产生对苯菌灵的抗药性[2]。据统计，到1987年止，至少有55个属的植物病原菌对这类药剂产生了抗药[1]。
增强型绿色萤光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)是水母体内的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因经改造后的突变体，在蓝色450～490 am波长范围的光线激发下，显示绿色萤光，比通用的GFP荧光显示程度更强，检测灵敏度更高。GFP作为一种报告分子，在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、蛋白质的结构及功能的研究中具有特殊的意义[3]。本研究用荧光蛋白标记禾谷镰孢菌的β2微管蛋白基因，利用荧光显微镜观察多菌灵对禾谷镰孢菌的作用。从而进一步从分子角度阐述多菌灵对禾谷镰孢菌的作用。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
表11 本研究所用菌株
Table11 Fusarium graminearum strains used in this study
菌株
相关特性
2021
野生多菌灵敏感性菌株
JT04
田间多菌灵高抗性菌株
FN2228
敏感性菌株2021β2微管蛋白基因与GFP融合突变体
FNJ539
田间高抗性菌株JTO4β2微管蛋白基因与GFP融合突变体
1.1.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)用于菌株的分离、纯化、一般培养与保存。3%绿豆汤培养液用于禾谷镰孢菌产生分生孢子。
YEPD2G:酵母粉3g,蛋白脉10g,葡萄糖20g,蒸馏水IL;
再生培养基:酵母粉1g,酶水解干酪素1g,琼脂16g,蔗糖274g,加蒸馏水定容至IL;
覆层培养基:同再生培养基,用10g琼脂糖取代琼脂并加入终浓度为100μg/mL的
潮霉素B便于对转化子的筛选。
1.1.3试剂
酶制剂:崩溃酶(Driselase,D)(Sigma公司),裂解酶(Lysing Enzyme,L)(Sigma公司),几丁质酶(Chitinase,C)(Sigma公司),蜗牛酶(Smailase,S)(北京百泰生化技术公司)。所有酶液用0.7mol/NaCI溶液配制,经700g离心2min后取上清,于20℃保存备用。
其他试剂:STC(0.8mol/L山梨糖醇,50mmol/LCaC12,50mmol/LTrisHCI,pH8.0) ; SPTC, 含40%PEG6000的STC;潮霉素B(hygromycin B,Calbioehem分装);二硫苏糖醇(DTT);肝素钠(5mg/mL)等。
1.2方法
1.2.1禾谷镰孢菌基因组DNA提取
(1)取0.2g禾谷镰孢菌菌丝，在液氮中迅速研磨成粉；
(2)加入800μL到65℃预热的DNA提取缓冲液(100mmol/L TtisHCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA(pH8.0)，1.5mol/L NaCl，2%CTAB(W/V))和80μL10%SDS，快速振荡混匀，65℃水浴3060min，期间混匀23次；
（3）1×104r/min离心5min，取上清夜，加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:2:1）抽提2次（1×104r/min离心10min）；
(4)取上清，1/10体积的NaAc（3mol/L）。2.5倍体积的无水乙醇，﹣20℃沉淀60min以上；
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引言
小麦赤霉病是一种分布很广的病害，全世界几乎所有的小麦产区都有该病发生。在我国，小麦赤霉病在中国小麦栽培地区都有发布，其中主要发生在长江中下游的冬麦区和东北的春麦区。
根据国内外报道，大约有20个种或变种的镰孢属真菌能引起小麦赤霉病，除禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）外，还有串珠镰孢菌（F. moniliforme Sheld）、黄色镰孢菌（F. culmorum）、燕麦镰孢菌（F. avenaceum）等。在我国引起小麦赤霄病的病原菌主要为禾谷镰孢菌。1976~1980年全国小麦赤霉病研究协作组鉴定了各麦区的2450份赤霉病穗标样，其中禾谷镰孢菌占总样品的94.5%。但近年来借助分子生物学手段发现一个引起小麦赤霉病的新种F. asiaticum。由于该种在生物学特性方面与难以区分，我国植物病理学者一直将其与作为同一个种进行研究，实际上我国在长江中下游地区是由这两种镰孢属真菌侵染小麦引起小麦赤霉病[1]。
禾谷镰孢菌不仅侵染小麦，而且还侵染大麦、燕麦、玉米等多种禾谷类作物。小麦从苗期到成株期均可遭受禾谷镰孢菌的侵染，分别引起苗腐、基腐、茎腐和穗腐。在中国的大部分地区，通常以穗腐危害损失最大，其次为苗腐。赤霉病的小麦生产的影响除造成减外，更主要的是该病菌分泌的毒素对麦粒的污染，人畜取食一定量的麦粒后会引起中毒，病粒达20%时，小麦便失去了食用和商品价值。小麦赤霉病的发生受气候和播种期等因素的影响较大，因此在不同年份发病不一。
苯并咪唑类杀菌剂是20世纪年代60末、70年代初开发的一类含有苯并咪唑分子结构的高效、广谱内吸性杀菌剂,这类药剂的成功开发和推广应用,被认为是世纪植物病害化学防治中最重要的事 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
件,标志着植物病害化学防治从此进入一个新的历史阶段。苯并咪喃类药剂中最大的一类为农用杀菌剂，对大多数子囊菌、半子菌和担子菌引起的病害均有防治效果，对半知菌中的链格孢属、轮枝菌属无效,对鞭毛菌亚门真菌和细菌引起的病害也没有防治效果。又因为该类药剂被首先发现具有植物内吸性，对病害具有治疗作用，该类杀菌剂主要作用于病原菌的微管蛋白，阻止纺锤丝的形成，从而干扰细胞核的分裂。因此这类药剂作用位点单一，选择性较强，病原菌在药剂选择压力下很容易产生抗药性，而且在高剂量压力下,病原菌抗药性群体很容易发生流行,最终导致防治失败[1]。
自从苯并咪唑类杀菌剂被作为控制许多危害性病原菌的最有效方式而被广泛应用以来,抗药性不可避免地成为植物保护过程中的一个重要问题。这类药剂在20世纪60年代后期问世，在1969年，就首次报道了黄瓜白粉病菌产生对苯菌灵的抗药性[2]。据统计，到1987年止，至少有55个属的植物病原菌对这类药剂产生了抗药[1]。
增强型绿色萤光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)是水母体内的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因经改造后的突变体，在蓝色450～490 am波长范围的光线激发下，显示绿色萤光，比通用的GFP荧光显示程度更强，检测灵敏度更高。GFP作为一种报告分子，在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、蛋白质的结构及功能的研究中具有特殊的意义[3]。本研究用荧光蛋白标记禾谷镰孢菌的β2微管蛋白基因，利用荧光显微镜观察多菌灵对禾谷镰孢菌的作用。从而进一步从分子角度阐述多菌灵对禾谷镰孢菌的作用。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
表11 本研究所用菌株
Table11 Fusarium graminearum strains used in this study
菌株
相关特性
2021
野生多菌灵敏感性菌株
JT04
田间多菌灵高抗性菌株
FN2228
敏感性菌株2021β2微管蛋白基因与GFP融合突变体
FNJ539
田间高抗性菌株JTO4β2微管蛋白基因与GFP融合突变体
1.1.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)用于菌株的分离、纯化、一般培养与保存。3%绿豆汤培养液用于禾谷镰孢菌产生分生孢子。
YEPD2G:酵母粉3g,蛋白脉10g,葡萄糖20g,蒸馏水IL;
再生培养基:酵母粉1g,酶水解干酪素1g,琼脂16g,蔗糖274g,加蒸馏水定容至IL;
覆层培养基:同再生培养基,用10g琼脂糖取代琼脂并加入终浓度为100μg/mL的
潮霉素B便于对转化子的筛选。
1.1.3试剂
酶制剂:崩溃酶(Driselase,D)(Sigma公司),裂解酶(Lysing Enzyme,L)(Sigma公司),几丁质酶(Chitinase,C)(Sigma公司),蜗牛酶(Smailase,S)(北京百泰生化技术公司)。所有酶液用0.7mol/NaCI溶液配制,经700g离心2min后取上清,于20℃保存备用。
其他试剂:STC(0.8mol/L山梨糖醇,50mmol/LCaC12,50mmol/LTrisHCI,pH8.0) ; SPTC, 含40%PEG6000的STC;潮霉素B(hygromycin B,Calbioehem分装);二硫苏糖醇(DTT);肝素钠(5mg/mL)等。
1.2方法
1.2.1禾谷镰孢菌基因组DNA提取
(1)取0.2g禾谷镰孢菌菌丝，在液氮中迅速研磨成粉；
(2)加入800μL到65℃预热的DNA提取缓冲液(100mmol/L TtisHCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA(pH8.0)，1.5mol/L NaCl，2%CTAB(W/V))和80μL10%SDS，快速振荡混匀，65℃水浴3060min，期间混匀23次；
（3）1×104r/min离心5min，取上清夜，加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:2:1）抽提2次（1×104r/min离心10min）；
(4)取上清，1/10体积的NaAc（3mol/L）。2.5倍体积的无水乙醇，﹣20℃沉淀60min以上；
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