银杏内生真菌nodulisporiumsp.a21的新抗菌化合物研究
: 植物内生菌是指其生活史在一定阶段或全部阶段生活在健康植物组织内或组织间的微生物。研究证明，作为一类生活在植物体内的特境微生物，植物内生菌与宿主形成了协同进化、互惠共生的关系，由此产生多种结构新颖和功能多样的次级代谢产物。低剂量高防效的需求以及有害生物抗药性的发展，促进了新农药研发的不断创新。从天然产物中筛选农药活性先导化合物是新农药创制的重要途径。因此，植物内生菌被认为是一种新的天然活性物质重要来源，在农业、医药等行业中具有广泛的应用前景。本课题组从银杏中分离得到一株内生真菌A21，经鉴定为多节孢属Nodulosporium sp.，GenBank登陆号KP297933）。初步研究表明其发酵液及其乙酸乙酯萃取物对植物病原菌具有显著的抑制活性。本课题拟对一株银杏内生真菌Nodulosporium sp. A21进行研究，在活性导向下分离其次生代谢产物，发现新活性化合物6个，进而为新型、高效、安全的农药先导化合物的研究与利用提供源头性成果。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 培养基2
1.1.3 主要仪器设备2
1.2 实验方法 2
1.2.1内生真菌发酵液制备及发酵液乙酸乙酯粗提物的制备2
1.2.2 菌株Nodulispium sp. A21不同有机溶剂提取物的制备2
2 结果与分析3
3 小结与讨论12
致谢13
参考文献13
银杏内生真菌Nodulisporium sp. A21的新抗菌化合物研究
引言
引言：植物内生真菌一般是指生活在植物组织体内的一类并不引起明显病害症状的真菌，几乎所有的植物组织中都发现有内生真菌的存在[1]，它是一个庞大的特殊真菌类群。内生真菌与宿主植物及其各种天敌之间在长期共进化的过程中形成了密切而又错综复杂的生态关系，而维持这种关系的物质基础是内生菌产生的和(或)由其诱导宿主植物合成的次生代谢产物[2]。
国内外大量研究表 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
明，内生菌可以合成多种结构新颖的次生代谢物质[35]，这些化合物在增强宿主植物对环境胁迫的抗性[6]、抵御有害生物侵袭[7]等方面扮演着十分重要的角色，其中很多具有抗菌、杀虫、植物生长调节等农药生物活性[8,9]。内生真菌次生代谢产物的化学结构多样性，在农业和医药业中具有重要的应用潜力。
多节孢属Nodulisporium真菌属于子囊菌门Ascomycota 粪壳菌纲Sordariomycetes 炭角菌目Xylariales 炭角菌科Xylariaceae[10]。迄今已报道多节孢属真菌次生代谢产物70余个，主要有生物碱、聚酮、萜及甾体等[11]，其代谢产物结构新颖多样。
此外本次实验应用了一项之前在此类试验中没有应用的技术，大孔树脂在提纯分离的应用。大孔吸附树脂(macroprous adsorption resin,MAR)是近几十年发展起来的一种具有多孔立体结构、人工合成的有机高分子聚合物。它是最近几年高分子领域里新发展起来的一种多孔性树脂，由苯乙烯和二乙烯苯等单体，在甲苯等有机溶剂存在下，通过悬浮共聚法制得的鱼籽样的小圆球。广泛用于废水处理、药剂分离和提纯，用作化学反应催化剂的载体，气体色谱分析及凝胶渗透色谱分子量分级柱的填料。由于其特殊的理化性质和吸附性能,已被广泛应用于化学、医药、环保和食品等领域。
基于此，本课题拟采用先进的天然有机化学、农药学以及色谱和波谱学的相关技术与方法，深入研究多节孢属真菌中的天然活性分子。为快速发现新活性物质，本项目拟以抗菌活性测试和1HNMR监测为分离导向，结合多种现代分离纯化及结构测定方法，分离和确定新化合物，并以抗植物病原菌活性作为评价系统，探讨Nodulosporium sp. A21中新成分的结构和功能的关系。利用该模式快速发掘化学结构新颖、生物活性显著的天然产物，为创制拥有我国自主知识产权的新型高效、低毒、选择性好的绿色农药提供先导化合物。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
大学植物保护学院天然药物化学实验室保存的银杏内生真菌菌种库
1.1.2 培养基
PDA：葡萄糖20g、马铃薯200g、琼脂20g、水1000mL。
PD：葡萄糖20g、马铃薯200g、水1000mL。
1.1.3 主要仪器设备
高压蒸汽灭菌锅 TOMY SX500 日本
摇床 QYC2102C 宁波江南仪器厂
恒温培养箱 SPX128 宁波江南仪器厂
旋转蒸发仪 EYELA N1100 日本
HPLC Aglient 1200 美国
超净工作台 AIRTECH SWCJ1F 江苏苏净集团
1.2 实验方法
1.2.1内生真菌发酵液（FB）制备及发酵液乙酸乙酯粗提物（CE）的制备
用0.5 cm打孔器将经活化的内生真菌制成菌饼，接种于液体培养基中（150mL PD/250mL三角瓶，10菌饼/瓶），25±1°C、150 rpm摇瓶黑暗培养5 d，将发酵液分别均匀倒入90个锥形瓶中，每瓶加入0.4L。发酵三天后每瓶加入12g大红树脂，接着置于摇床上发酵12d，至有大量菌丝球出现，经100目尼龙网过滤得菌体和发酵液（FB）。发酵液用乙酸乙酯萃取3次，浓缩蒸干，得到菌株发酵液乙酸乙酯粗提物浸膏（CE），4°C保存。
1.2.2菌株Nodulispium sp. A21不同有机溶剂提取物的制备
发酵液分别用不同有机溶剂萃取：石油醚:乙酸乙酯（100:8）过硅胶柱，获得萃取物后静置结晶；二氯甲烷过硅胶柱后没有得到有效的结晶；二氯甲烷：甲醇（100:1）过ODS后，分别得到两种不同结晶;二氯甲烷：甲醇（100:2）过ODS后得到结晶物和混合膏状物质，此膏状物分别过二氯甲烷：甲醇（100:16）和（100:32），（100:32）的萃取物过HPLC后得到纯净结晶物;二氯甲烷：甲醇（100:4）过ODS后得到纯净结晶体。流程图如下：
2 结果与分析
将之前得到的六种纯净结晶物进行氢谱图分析鉴定。氢原子具有磁性，如电磁波照射氢原子核，它能通过共振吸收电磁波能量，发生跃迁。用核磁共振仪可以记录到有关信号，处在不同环境中的氢原子因产生共振时吸收电磁波的频率不同，在图谱上出现的位置也不同，各种氢原子的这种差异被称为化学位移。氢原子在分子中的化学环境不同，而显示出不同的吸收峰，峰与峰之间的差距被称作化学位移；化学位移的大小，可采用一个标准化合物为原点，测出峰与原点的距离，就是该峰的化学位移，现在一般采用(CH3)4Si(四甲基硅烷TMS)为标准化合物，其化学位移值为0 ppm。利用化学位移，峰面积和积分值以及耦合常数等信息，进而推测其在碳骨架上的位置。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 培养基2
1.1.3 主要仪器设备2
1.2 实验方法 2
1.2.1内生真菌发酵液制备及发酵液乙酸乙酯粗提物的制备2
1.2.2 菌株Nodulispium sp. A21不同有机溶剂提取物的制备2
2 结果与分析3
3 小结与讨论12
致谢13
参考文献13
银杏内生真菌Nodulisporium sp. A21的新抗菌化合物研究
引言
引言：植物内生真菌一般是指生活在植物组织体内的一类并不引起明显病害症状的真菌，几乎所有的植物组织中都发现有内生真菌的存在[1]，它是一个庞大的特殊真菌类群。内生真菌与宿主植物及其各种天敌之间在长期共进化的过程中形成了密切而又错综复杂的生态关系，而维持这种关系的物质基础是内生菌产生的和(或)由其诱导宿主植物合成的次生代谢产物[2]。
国内外大量研究表 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
明，内生菌可以合成多种结构新颖的次生代谢物质[35]，这些化合物在增强宿主植物对环境胁迫的抗性[6]、抵御有害生物侵袭[7]等方面扮演着十分重要的角色，其中很多具有抗菌、杀虫、植物生长调节等农药生物活性[8,9]。内生真菌次生代谢产物的化学结构多样性，在农业和医药业中具有重要的应用潜力。
多节孢属Nodulisporium真菌属于子囊菌门Ascomycota 粪壳菌纲Sordariomycetes 炭角菌目Xylariales 炭角菌科Xylariaceae[10]。迄今已报道多节孢属真菌次生代谢产物70余个，主要有生物碱、聚酮、萜及甾体等[11]，其代谢产物结构新颖多样。
此外本次实验应用了一项之前在此类试验中没有应用的技术，大孔树脂在提纯分离的应用。大孔吸附树脂(macroprous adsorption resin,MAR)是近几十年发展起来的一种具有多孔立体结构、人工合成的有机高分子聚合物。它是最近几年高分子领域里新发展起来的一种多孔性树脂，由苯乙烯和二乙烯苯等单体，在甲苯等有机溶剂存在下，通过悬浮共聚法制得的鱼籽样的小圆球。广泛用于废水处理、药剂分离和提纯，用作化学反应催化剂的载体，气体色谱分析及凝胶渗透色谱分子量分级柱的填料。由于其特殊的理化性质和吸附性能,已被广泛应用于化学、医药、环保和食品等领域。
基于此，本课题拟采用先进的天然有机化学、农药学以及色谱和波谱学的相关技术与方法，深入研究多节孢属真菌中的天然活性分子。为快速发现新活性物质，本项目拟以抗菌活性测试和1HNMR监测为分离导向，结合多种现代分离纯化及结构测定方法，分离和确定新化合物，并以抗植物病原菌活性作为评价系统，探讨Nodulosporium sp. A21中新成分的结构和功能的关系。利用该模式快速发掘化学结构新颖、生物活性显著的天然产物，为创制拥有我国自主知识产权的新型高效、低毒、选择性好的绿色农药提供先导化合物。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
大学植物保护学院天然药物化学实验室保存的银杏内生真菌菌种库
1.1.2 培养基
PDA：葡萄糖20g、马铃薯200g、琼脂20g、水1000mL。
PD：葡萄糖20g、马铃薯200g、水1000mL。
1.1.3 主要仪器设备
高压蒸汽灭菌锅 TOMY SX500 日本
摇床 QYC2102C 宁波江南仪器厂
恒温培养箱 SPX128 宁波江南仪器厂
旋转蒸发仪 EYELA N1100 日本
HPLC Aglient 1200 美国
超净工作台 AIRTECH SWCJ1F 江苏苏净集团
1.2 实验方法
1.2.1内生真菌发酵液（FB）制备及发酵液乙酸乙酯粗提物（CE）的制备
用0.5 cm打孔器将经活化的内生真菌制成菌饼，接种于液体培养基中（150mL PD/250mL三角瓶，10菌饼/瓶），25±1°C、150 rpm摇瓶黑暗培养5 d，将发酵液分别均匀倒入90个锥形瓶中，每瓶加入0.4L。发酵三天后每瓶加入12g大红树脂，接着置于摇床上发酵12d，至有大量菌丝球出现，经100目尼龙网过滤得菌体和发酵液（FB）。发酵液用乙酸乙酯萃取3次，浓缩蒸干，得到菌株发酵液乙酸乙酯粗提物浸膏（CE），4°C保存。
1.2.2菌株Nodulispium sp. A21不同有机溶剂提取物的制备
发酵液分别用不同有机溶剂萃取：石油醚:乙酸乙酯（100:8）过硅胶柱，获得萃取物后静置结晶；二氯甲烷过硅胶柱后没有得到有效的结晶；二氯甲烷：甲醇（100:1）过ODS后，分别得到两种不同结晶;二氯甲烷：甲醇（100:2）过ODS后得到结晶物和混合膏状物质，此膏状物分别过二氯甲烷：甲醇（100:16）和（100:32），（100:32）的萃取物过HPLC后得到纯净结晶物;二氯甲烷：甲醇（100:4）过ODS后得到纯净结晶体。流程图如下：
2 结果与分析
将之前得到的六种纯净结晶物进行氢谱图分析鉴定。氢原子具有磁性，如电磁波照射氢原子核，它能通过共振吸收电磁波能量，发生跃迁。用核磁共振仪可以记录到有关信号，处在不同环境中的氢原子因产生共振时吸收电磁波的频率不同，在图谱上出现的位置也不同，各种氢原子的这种差异被称为化学位移。氢原子在分子中的化学环境不同，而显示出不同的吸收峰，峰与峰之间的差距被称作化学位移；化学位移的大小，可采用一个标准化合物为原点，测出峰与原点的距离，就是该峰的化学位移，现在一般采用(CH3)4Si(四甲基硅烷TMS)为标准化合物，其化学位移值为0 ppm。利用化学位移，峰面积和积分值以及耦合常数等信息，进而推测其在碳骨架上的位置。
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