本氏烟一个wrky类转录因子的抗疫霉功能初探
摘要：寻找抗疫霉相关转录因子，对植物抗疫霉基因工程具有重要的意义。本研究参考文献报道结果，结合基因同源比对法，挑选本氏烟中一个WRKY类转录因子，并命名为NBwizz，通过在本氏烟上建立的病毒诱导基因沉默技术（Virus-induced gene silencing，VIGS），结合本氏烟对烟草疫霉的抗病性结果，初步分析其抗疫霉相关特性。首先检测拟沉默的候选转录因子NBwizz的沉默效率，结果表明其沉默效率达55%以上。在NBwizz基因沉默的本氏烟上接种辣椒疫霉游动孢子，并在接种后的不同时间点，在紫外灯下观察烟草叶片细胞坏死情况，并统计病斑的大小。结果表明，接种辣椒疫霉游动孢子后的24 和30 h，沉默效率达55%以上的烟草叶片的病斑直径比值分别是1.232和1.188，与注射对照pTRV的烟草叶片相比，NBwizz沉默的烟草叶片上的病斑扩展明显加快，表明NBwizz的沉默减弱了本氏烟对烟草疫霉的抗病性，该基因在抗病中具有重要作用，这为进一步研究该转录因子的抗疫霉功能机制和植物抗病性奠定了工作基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2相关WRKY类转录因子的基因克隆与载体构建 3
1.3感受态细胞的制备和转化3
1.4病毒诱导的基因沉默4
1.5本氏烟RNA的提取5
1.6逆转录RNA5
1.7荧光定量PCR5
1.8辣椒疫霉游动孢子的培养5
1.9本氏烟对辣椒疫霉的抗病性实验6
2结果与分析6
2.1本氏烟中抗疫霉相关WRKY类转录因子的筛选6
2.2本氏烟中疫霉抗性相关WRKY类转录因子的载体构建7
2.3 NBwizz基因沉默后本氏烟对辣椒疫霉的抗性降低8
3讨论 9
致谢10
参考文献10
本氏烟一个WRKY类转录因子的抗疫霉功能初探
引言
疫霉菌是疫霉属(Phytophthora de Bary)真菌的通称，隶属鞭毛菌
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
亚门，卵菌纲，霜霉目，腐霉科，是一类重要的植物病原菌，由疫霉菌所引起的植物病害通常称为“疫病”（刘君丽等，2003）。疫霉菌潜育期短，传播速度快，侵染力强，再侵染次数多，在植物的一个生长季节内病菌可迅速发展造成病害流行，最终造成农业生产的巨大（王前涛，2012）。比如发生在1847年的由致病疫霉(P. infestans de Bary)引起的马铃薯晚疫病，造成了近百万人死亡的大饥荒，成为人类史举世闻名的“爱尔兰大饥荒”（刘君丽等，2003）。
近年来，科学家们通过基因工程技术将抗疫霉的基因引入植物中，从而提高植物的抗病性（刘彦锋等，2005）。在农业防治、抗病品种选育、生物防治和化学防治等诸多防治疫病的措施中，尽管转基因作物和生物防治已成为当今植物保护领域研究的热点，但化学防治仍是当前控制疫霉病害的主要手段（王前涛，2012）。化学防治仍面临着病菌对化学药剂产生抗药性和致病力变异导致作物品种抗病性丧失等问题（刘君丽等，2003）。由于疫霉基因组结构的复杂性，长期在相对单一抗源的选择压力下，其无毒基因会发生快速的进化和变异，导致识别这些无毒基因的抗病基因在短时间内就会丧失抗性。因此，植物抗疫霉育种还面临巨大的挑战，而转基因技术将是植物抗疫霉育种的一个补充，但目前在生产上还缺乏功能清楚的有应用潜力的基因。
转录因子也称反式作用因子，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录(张椿雨等，2007)。目前，研究转录因子功能的方法主要有瞬间转化分析、突变分析，以及近年来发展起来的RNA干涉技术等（杨致荣等，2004）。最近几年对高等植物转录因子的研究进展迅速，特别是对转录因子结构与功能研究取得了惊人的进展。尽管如此，我们仍面临着许多问题。现阶段对转录因子的研究主要以一些模式植物为主，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotiana tabacum）、水稻（Oryza sativa）等。并集中在转录因子的分离克隆、功能、特性研究方面，有关其对下游基因调控机制的研究甚少，特别是在转录因子所介导的植物应答反应过程中的研究仍很模糊，尚无法确定其上、下游结合因子以及在各种抗病信号转导过程中的作用。另外传统上研究转录因子，是基于遗传学的方法，通过基因过表达或缺失突变体的异常表型来分析的（崔艳红等，2009）。因其需要得到大量的转基因植株而表现出耗时长、工作量大的问题。
WRKY转录因子最初被认为是植物特有的一类转录因子(Eulgem et al.，2000)，但是在随后的研究中发现，WRKY基因起源于原核生物，在其它较原始的生物中也发现有少量的WRKY基因存在；在被子植物中，WRKY基因数目众多，形成了一个转录因子超家族(Wu et al.，2005)。研究表明WRKY转录因子参与植物多种重要生理生化过程，从而调控植物生长发育、胁迫应答等各种重要生理过程。目前的研究主要集中在WRKY转录因子的基因克隆、结构鉴定、表达及其相关功能分析等初步阶段。事实上，WRKY转录因子所介导的植物应答反应过程仍十分模糊，且其研究大多是在模式植物中的研究(陈欧等，2008)。
针对以上问题，本研究参考文献报道结果，结合基因同源比对法，挑选本氏烟中一个WRKY类转录因子，基于该基因与普通烟（Nicotiana tabacum）中已报道的受伤口诱导表达的wizz基因有很高的同源性，我们将此基因命名为NBwizz，通过在本氏烟上建立的病毒诱导基因沉默技术（Virusinduced gene silencing，VIGS），结合本氏烟对烟草疫霉的抗病性结果，初步分析其抗疫霉相关特性。本实验为进一步研究该转录因子的抗疫霉功能奠定工作基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试菌株和病毒载体 感受态细胞（大肠杆菌Eschrichia coli）：DH5α；感受态细胞（农杆菌Agrobacterium tumefaciens）：GV3101；辣椒疫霉（Pytophthora capsici）；烟草脆裂病毒（pTRV1、pTRV2）载体。
1．1．2 供试培养基
1．1．2．1 LB培养基
蛋白胨 10 g
酵母提取物 5 g
NaCl 10 g
注：配制固体LB培养基，每分装200 ml，分别加入3 g琼脂粉。
1．1．2．2 V8培养基
a. 340 ml V8营养液，加入3.4 g CaCO3 ，充分搅匀；
b. 分装在50 ml的离心管中；
c. 5000 rpm离心10 min；
d. 用三层干净的纱布叠在一起，过滤收集滤液，稀释810倍，分装；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2相关WRKY类转录因子的基因克隆与载体构建 3
1.3感受态细胞的制备和转化3
1.4病毒诱导的基因沉默4
1.5本氏烟RNA的提取5
1.6逆转录RNA5
1.7荧光定量PCR5
1.8辣椒疫霉游动孢子的培养5
1.9本氏烟对辣椒疫霉的抗病性实验6
2结果与分析6
2.1本氏烟中抗疫霉相关WRKY类转录因子的筛选6
2.2本氏烟中疫霉抗性相关WRKY类转录因子的载体构建7
2.3 NBwizz基因沉默后本氏烟对辣椒疫霉的抗性降低8
3讨论 9
致谢10
参考文献10
本氏烟一个WRKY类转录因子的抗疫霉功能初探
引言
疫霉菌是疫霉属(Phytophthora de Bary)真菌的通称，隶属鞭毛菌
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
亚门，卵菌纲，霜霉目，腐霉科，是一类重要的植物病原菌，由疫霉菌所引起的植物病害通常称为“疫病”（刘君丽等，2003）。疫霉菌潜育期短，传播速度快，侵染力强，再侵染次数多，在植物的一个生长季节内病菌可迅速发展造成病害流行，最终造成农业生产的巨大（王前涛，2012）。比如发生在1847年的由致病疫霉(P. infestans de Bary)引起的马铃薯晚疫病，造成了近百万人死亡的大饥荒，成为人类史举世闻名的“爱尔兰大饥荒”（刘君丽等，2003）。
近年来，科学家们通过基因工程技术将抗疫霉的基因引入植物中，从而提高植物的抗病性（刘彦锋等，2005）。在农业防治、抗病品种选育、生物防治和化学防治等诸多防治疫病的措施中，尽管转基因作物和生物防治已成为当今植物保护领域研究的热点，但化学防治仍是当前控制疫霉病害的主要手段（王前涛，2012）。化学防治仍面临着病菌对化学药剂产生抗药性和致病力变异导致作物品种抗病性丧失等问题（刘君丽等，2003）。由于疫霉基因组结构的复杂性，长期在相对单一抗源的选择压力下，其无毒基因会发生快速的进化和变异，导致识别这些无毒基因的抗病基因在短时间内就会丧失抗性。因此，植物抗疫霉育种还面临巨大的挑战，而转基因技术将是植物抗疫霉育种的一个补充，但目前在生产上还缺乏功能清楚的有应用潜力的基因。
转录因子也称反式作用因子，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录(张椿雨等，2007)。目前，研究转录因子功能的方法主要有瞬间转化分析、突变分析，以及近年来发展起来的RNA干涉技术等（杨致荣等，2004）。最近几年对高等植物转录因子的研究进展迅速，特别是对转录因子结构与功能研究取得了惊人的进展。尽管如此，我们仍面临着许多问题。现阶段对转录因子的研究主要以一些模式植物为主，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotiana tabacum）、水稻（Oryza sativa）等。并集中在转录因子的分离克隆、功能、特性研究方面，有关其对下游基因调控机制的研究甚少，特别是在转录因子所介导的植物应答反应过程中的研究仍很模糊，尚无法确定其上、下游结合因子以及在各种抗病信号转导过程中的作用。另外传统上研究转录因子，是基于遗传学的方法，通过基因过表达或缺失突变体的异常表型来分析的（崔艳红等，2009）。因其需要得到大量的转基因植株而表现出耗时长、工作量大的问题。
WRKY转录因子最初被认为是植物特有的一类转录因子(Eulgem et al.，2000)，但是在随后的研究中发现，WRKY基因起源于原核生物，在其它较原始的生物中也发现有少量的WRKY基因存在；在被子植物中，WRKY基因数目众多，形成了一个转录因子超家族(Wu et al.，2005)。研究表明WRKY转录因子参与植物多种重要生理生化过程，从而调控植物生长发育、胁迫应答等各种重要生理过程。目前的研究主要集中在WRKY转录因子的基因克隆、结构鉴定、表达及其相关功能分析等初步阶段。事实上，WRKY转录因子所介导的植物应答反应过程仍十分模糊，且其研究大多是在模式植物中的研究(陈欧等，2008)。
针对以上问题，本研究参考文献报道结果，结合基因同源比对法，挑选本氏烟中一个WRKY类转录因子，基于该基因与普通烟（Nicotiana tabacum）中已报道的受伤口诱导表达的wizz基因有很高的同源性，我们将此基因命名为NBwizz，通过在本氏烟上建立的病毒诱导基因沉默技术（Virusinduced gene silencing，VIGS），结合本氏烟对烟草疫霉的抗病性结果，初步分析其抗疫霉相关特性。本实验为进一步研究该转录因子的抗疫霉功能奠定工作基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试菌株和病毒载体 感受态细胞（大肠杆菌Eschrichia coli）：DH5α；感受态细胞（农杆菌Agrobacterium tumefaciens）：GV3101；辣椒疫霉（Pytophthora capsici）；烟草脆裂病毒（pTRV1、pTRV2）载体。
1．1．2 供试培养基
1．1．2．1 LB培养基
蛋白胨 10 g
酵母提取物 5 g
NaCl 10 g
注：配制固体LB培养基，每分装200 ml，分别加入3 g琼脂粉。
1．1．2．2 V8培养基
a. 340 ml V8营养液，加入3.4 g CaCO3 ，充分搅匀；
b. 分装在50 ml的离心管中；
c. 5000 rpm离心10 min；
d. 用三层干净的纱布叠在一起，过滤收集滤液，稀释810倍，分装；
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/730.html
