水稻与芽孢杆菌互作启动的信号通路分析
摘要：本实验室前期已通过转录组测序验证菌株解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens 菌株FZB42与籼稻9311（Oryza sativa subsp.indica）互作后，能够诱导水稻体内多条信号传导通路及多条代谢途径中相关基因的调控表达，从而整体促进植物生长发育并诱导植物的抗病性。在此前提下，本实验通过提取根部和叶部的RNA并反转录为cDNA，随后以Real-Time PCR方法检测和验证此转录组测序分析结果，分析芽孢杆菌处理水稻后启动的信号传导通路和代谢通路。结果表明：芽孢杆菌FZB42在不同时间都能够诱导水稻体内生长素、茉莉酸、油菜素内酯等芽孢杆菌促生相关信号通路的标志基因显著上调表达，并且与芽孢杆菌诱导植物抗病性相关的丝裂原活化蛋白激酶、病程相关蛋白、WRKY转录因子信号通路在0-12h的不同时间也都能够上调表达，与本实验室之前的转录组测序结果一致，从转录水平证实了芽孢杆菌能够促进植物生长发育及诱导植物抗病性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 植物材料与供试菌株2
1.2 实验仪器 2
1.3 实验材料培养2
1.3.1 植物材料培养2
1.3.2 芽孢杆菌菌悬液培养2
1.4 水稻与芽孢杆菌互作处理2
1.5 RealtimePCR验证2
1.5.1 植物材料处理2
1.5.2 水稻RNA的提取 3
1.5.3 mRNA反转录为cDNA3
1.5.4 Realtime PCR验证3
1.5.4.1 Realtime PCR引物设计4
1.5.4.2 Realtime PCR体系4
1.5.4.3 Realtime PCR反应条件4
2 结果与分析4
2.1 水稻叶部应答生防芽孢杆菌互作5
2.1.1 与芽孢杆菌促生相关的植物激素信号传导通路5
2.1.2 与芽孢杆菌诱导植物抗病性相关的通路5
2.2 水稻根部应答生防芽孢杆
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
菌互作7
2.2.1 与芽孢杆菌促生相关的植物激素信号传导通路7
2.2.2 与芽孢杆菌诱导植物抗病性相关的通路7
3 讨论8
致谢9
参考文献10
水稻与芽孢杆菌互作启动的信号通路分析
引言
芽孢杆菌是一类重要的植物根围促生菌（Plant Growth Promotion rhizobacteria, PGPR），与植物之间存在着有益的互作关系[1]。植物根部可为根围菌提供良好的生态位，根围菌可利用植物根部释放的营养物质进行生长繁殖，同时根围菌也合成一些代谢产物分泌到植物根际来影响植物生长，在互作过程中，植物根部与根围菌相互诱导、相互作用，刺激根围菌合成生物活性代谢产物，分泌到胞外来促进植物生长和诱导植物产生抗性。芽孢杆菌对植物的直接促生机制包括：产生植物激素促进植物生长，产生促生挥发性化合物（Volatiles）促进植物生长；通过促进植物对难溶性磷、铁等元素的吸收和微量元素的释放，提高植物根际养分的可利用性，而促进植物生长[2]。芽孢杆菌对植物的间接促生作用包括：刺激植物产生诱导系统抗性（Induced Systemic Resistance，ISR)，抑制植物病害发生，从而促进植物生长[3]。近年来国内外对于芽孢杆菌各方面应用的研究日益增多,枯草芽孢杆菌作为一种生防细菌越来越引起人们的关注[4]。目前 ,应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、土壤放射杆菌(Agrobacterium radiobacter)等[5]。在植物与芽孢杆菌的互作中，芽孢杆菌通过多途径促生机制的相互作用、相互影响促进植物的生长及提高植物抗病性，芽孢杆菌的促生和防病机制是一个综合作用的结果[6]。
本实验室前期已经完成了与芽孢杆菌FZB42互作后水稻9311的转录组测序分析。测序结果表明：芽孢杆菌FZB42能够诱导水稻体内多条信号传导通路及多条代谢途径中相关基因的调控表达，从而整体促进植物生长发育并诱导植物的抗病性[6]，为了验证此转录组测序结果，分析芽孢杆菌处理水稻后启动的信号传导通路和代谢通路，探究芽孢杆菌促进植物生长及诱导植物抗病性的作用机制。本研究用芽孢杆菌FZB42处理水稻后，提取根部及叶部RNA并反转录为cDNA，随后以RealTime PCR方法进行检测和验证，分析芽孢杆菌处理水稻后启动的信号传导通路和代谢通路的时序性，探究芽孢杆菌促进植物生长及诱导植物抗病性的作用机制。
1 材料与方法
1．1 植物材料及供试菌株
植物材料：籼稻9311(Oryza sativa subsp. indica)；
供试菌株：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens FZB42。
1．2 实验仪器
光照培养箱、摇床、高压灭菌锅、70℃冰箱、离心机、恒温金属浴、BIORAD PCR仪
1．3 实验材料培养
1．3．1 植物材料培养
选取籽粒饱满的籼稻9311水稻种子于20%的次氯酸钠溶液中消毒处理20min，之后以无菌水漂洗种子表面34次。无菌水处理后的种子置于无菌水中浸种24h，待种子露白后，将种子卷入圆形滤纸中，每张滤纸卷包裹8枚种子，将滤纸卷竖直放入盛有清水的塑料杯中，水面不超过种子所在位置，光照培养箱中培养（28°C，光周期16h/8h）10 d左右。
1．3．2 芽孢杆菌菌悬液制备
用接种环蘸取少量70°C保存的B. amyloliquefaciens FZB42菌液在LB固体平板上划线，37 °C恒温培养过夜，待LB平板上长出单菌落后，挑取单菌落接种到20ml LB液体培养基中，37 °C培养12 h，将培养好的菌液离心取菌体，用无菌水悬浮，菌液细胞浓度调整至106cfu/mL，制备成芽孢杆菌菌悬液。
1．4 水稻与芽孢杆菌互作处理
水稻幼苗培养10 d后，将幼苗从滤纸卷中取出，用干滤纸稍稍吸干幼苗根部水分，注意不损伤幼苗任何部位。将幼苗根部完全浸入B. amyloliquefaciens FZB42 菌悬液（菌液细胞浓度为106cfu/ml）中，菌悬液与水稻幼苗根部互作处理，无菌水处理作为对照。处理完毕后，以无菌水漂洗根部残留菌体，用滤纸稍稍吸干根部水份，迅速剪取水稻幼苗的根部及叶部，迅速包裹于锡纸中，在液氮中速冻，置于70℃冷冻保存，为realtime PCR验证备用。
1．5 Realtime PCR验证
1．5．1 植物材料处理
同1.4所述，将培养10 d 的水稻幼苗根部浸入菌株FZB42菌悬液（菌液浓度为106cfu/ml）中浸根，分别互作处理2 h、4 h、8 h、12 h，以无菌水处理对照。处理完毕后，以无菌水漂洗根部残留菌体，用滤纸稍稍吸干根部水分，将水稻幼苗分别剪取根部及叶部，迅速包裹于锡纸中，在液氮中速冻，置于70℃冷冻保存，为realtime PCR验证备用。
1．5．2 水稻RNA的提取
使用OMEGA公司Plant RNA Kit（50次）试剂盒提取水稻叶部及根部RNA。提取RNA所用到的所有耗材和器皿都要进行RNase清除处理；玻璃器皿于180℃的高温烘烤8h；塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可彻底去除RNase。有机玻璃电泳槽等，先用去污剂洗涤，超纯水冲洗，乙醇干燥，再在过氧化氢中浸泡10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。RNA提取具体操作步骤如下：
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 植物材料与供试菌株2
1.2 实验仪器 2
1.3 实验材料培养2
1.3.1 植物材料培养2
1.3.2 芽孢杆菌菌悬液培养2
1.4 水稻与芽孢杆菌互作处理2
1.5 RealtimePCR验证2
1.5.1 植物材料处理2
1.5.2 水稻RNA的提取 3
1.5.3 mRNA反转录为cDNA3
1.5.4 Realtime PCR验证3
1.5.4.1 Realtime PCR引物设计4
1.5.4.2 Realtime PCR体系4
1.5.4.3 Realtime PCR反应条件4
2 结果与分析4
2.1 水稻叶部应答生防芽孢杆菌互作5
2.1.1 与芽孢杆菌促生相关的植物激素信号传导通路5
2.1.2 与芽孢杆菌诱导植物抗病性相关的通路5
2.2 水稻根部应答生防芽孢杆
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
菌互作7
2.2.1 与芽孢杆菌促生相关的植物激素信号传导通路7
2.2.2 与芽孢杆菌诱导植物抗病性相关的通路7
3 讨论8
致谢9
参考文献10
水稻与芽孢杆菌互作启动的信号通路分析
引言
芽孢杆菌是一类重要的植物根围促生菌（Plant Growth Promotion rhizobacteria, PGPR），与植物之间存在着有益的互作关系[1]。植物根部可为根围菌提供良好的生态位，根围菌可利用植物根部释放的营养物质进行生长繁殖，同时根围菌也合成一些代谢产物分泌到植物根际来影响植物生长，在互作过程中，植物根部与根围菌相互诱导、相互作用，刺激根围菌合成生物活性代谢产物，分泌到胞外来促进植物生长和诱导植物产生抗性。芽孢杆菌对植物的直接促生机制包括：产生植物激素促进植物生长，产生促生挥发性化合物（Volatiles）促进植物生长；通过促进植物对难溶性磷、铁等元素的吸收和微量元素的释放，提高植物根际养分的可利用性，而促进植物生长[2]。芽孢杆菌对植物的间接促生作用包括：刺激植物产生诱导系统抗性（Induced Systemic Resistance，ISR)，抑制植物病害发生，从而促进植物生长[3]。近年来国内外对于芽孢杆菌各方面应用的研究日益增多,枯草芽孢杆菌作为一种生防细菌越来越引起人们的关注[4]。目前 ,应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、土壤放射杆菌(Agrobacterium radiobacter)等[5]。在植物与芽孢杆菌的互作中，芽孢杆菌通过多途径促生机制的相互作用、相互影响促进植物的生长及提高植物抗病性，芽孢杆菌的促生和防病机制是一个综合作用的结果[6]。
本实验室前期已经完成了与芽孢杆菌FZB42互作后水稻9311的转录组测序分析。测序结果表明：芽孢杆菌FZB42能够诱导水稻体内多条信号传导通路及多条代谢途径中相关基因的调控表达，从而整体促进植物生长发育并诱导植物的抗病性[6]，为了验证此转录组测序结果，分析芽孢杆菌处理水稻后启动的信号传导通路和代谢通路，探究芽孢杆菌促进植物生长及诱导植物抗病性的作用机制。本研究用芽孢杆菌FZB42处理水稻后，提取根部及叶部RNA并反转录为cDNA，随后以RealTime PCR方法进行检测和验证，分析芽孢杆菌处理水稻后启动的信号传导通路和代谢通路的时序性，探究芽孢杆菌促进植物生长及诱导植物抗病性的作用机制。
1 材料与方法
1．1 植物材料及供试菌株
植物材料：籼稻9311(Oryza sativa subsp. indica)；
供试菌株：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens FZB42。
1．2 实验仪器
光照培养箱、摇床、高压灭菌锅、70℃冰箱、离心机、恒温金属浴、BIORAD PCR仪
1．3 实验材料培养
1．3．1 植物材料培养
选取籽粒饱满的籼稻9311水稻种子于20%的次氯酸钠溶液中消毒处理20min，之后以无菌水漂洗种子表面34次。无菌水处理后的种子置于无菌水中浸种24h，待种子露白后，将种子卷入圆形滤纸中，每张滤纸卷包裹8枚种子，将滤纸卷竖直放入盛有清水的塑料杯中，水面不超过种子所在位置，光照培养箱中培养（28°C，光周期16h/8h）10 d左右。
1．3．2 芽孢杆菌菌悬液制备
用接种环蘸取少量70°C保存的B. amyloliquefaciens FZB42菌液在LB固体平板上划线，37 °C恒温培养过夜，待LB平板上长出单菌落后，挑取单菌落接种到20ml LB液体培养基中，37 °C培养12 h，将培养好的菌液离心取菌体，用无菌水悬浮，菌液细胞浓度调整至106cfu/mL，制备成芽孢杆菌菌悬液。
1．4 水稻与芽孢杆菌互作处理
水稻幼苗培养10 d后，将幼苗从滤纸卷中取出，用干滤纸稍稍吸干幼苗根部水分，注意不损伤幼苗任何部位。将幼苗根部完全浸入B. amyloliquefaciens FZB42 菌悬液（菌液细胞浓度为106cfu/ml）中，菌悬液与水稻幼苗根部互作处理，无菌水处理作为对照。处理完毕后，以无菌水漂洗根部残留菌体，用滤纸稍稍吸干根部水份，迅速剪取水稻幼苗的根部及叶部，迅速包裹于锡纸中，在液氮中速冻，置于70℃冷冻保存，为realtime PCR验证备用。
1．5 Realtime PCR验证
1．5．1 植物材料处理
同1.4所述，将培养10 d 的水稻幼苗根部浸入菌株FZB42菌悬液（菌液浓度为106cfu/ml）中浸根，分别互作处理2 h、4 h、8 h、12 h，以无菌水处理对照。处理完毕后，以无菌水漂洗根部残留菌体，用滤纸稍稍吸干根部水分，将水稻幼苗分别剪取根部及叶部，迅速包裹于锡纸中，在液氮中速冻，置于70℃冷冻保存，为realtime PCR验证备用。
1．5．2 水稻RNA的提取
使用OMEGA公司Plant RNA Kit（50次）试剂盒提取水稻叶部及根部RNA。提取RNA所用到的所有耗材和器皿都要进行RNase清除处理；玻璃器皿于180℃的高温烘烤8h；塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可彻底去除RNase。有机玻璃电泳槽等，先用去污剂洗涤，超纯水冲洗，乙醇干燥，再在过氧化氢中浸泡10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。RNA提取具体操作步骤如下：
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