葡萄炭疽病菌对咯菌腈氟啶胺苯醚甲环唑的敏感性基线建立
近年来，葡萄炭疽病发生逐年加重，成为其产业发展的瓶颈因子。因缺乏抗病品种，化学药剂仍然是防控该病的主要应急措施。本研究采用菌落直径法,利用采自江苏镇江市的80株葡萄炭疽病菌分别建立了其对咯菌腈、氟啶胺和苯醚甲环唑三种杀菌剂敏感性（EC50）基线0.0977±0.0429μg/ml、0.1108±0.1072μg/ml和0.4524±0.2411μg/ml，EC50值分布均成单峰曲线。该研究为葡萄炭疽病化学防控和抗药性监测奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract...1
Key words.1
前言2
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1供试菌株2
1.1.2 供试药剂..2
1.2 方法..2
1.2.1培养基的制备..2
1.2.2药剂制备2
1.2.3药剂浓度梯度设定2
1.2.4 菌株分离2
1.3 葡萄炭疽病对不同类型杀菌剂敏感性测定2
1.3.1 菌株活化2
1.3.2含药培养基制备2
1.3.3 毒力测定...3
2结果与分析....3
2.1葡萄炭疽病菌对咯菌腈、氟啶胺、苯醚甲环唑敏感性3
2.2 葡萄炭疽病菌对咯菌腈、氟啶胺、苯醚甲环唑敏感性基线的建立8
3讨论10
致谢11
参考文献12
葡萄炭疽病菌对咯菌腈、氟啶胺、苯醚甲环唑的敏感性基线建立
引言
葡萄炭疽病又称晚腐病，是由Colletotrichum gloeosporioides 引起的一种重要的常见病害，在全国葡萄主产区均有分布[12]，为害严重，给葡萄种植业的健康发展造成了严重的影响[34]。目前，我国南方产区该病发生较为普遍，有些年份发病非常严重；北方地区尤其是环渤海湾的酿酒葡萄产区炭疽病为害比较严重；西部地区几乎无葡萄炭疽病发生[5]。葡萄炭疽病主要为害着色期或近成熟期的果实，受害初期果粒上产生褐色圆形小斑点，后逐渐扩大凹陷产生轮纹状排列小黑点，潮湿天气病斑长出粉红色黏状物，严 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
重时病斑扩展至半个果粒，引起果粒腐烂[6]。由于缺少抗病品种，化学防控仍然是控制该病的主要方法[7]。咯菌腈（fludioxonil）是天然产物硝吡咯菌素（pyrrolnitrin）的类似物，作用于菌体MAPK途径中的渗透信号传导部分，进而抑制病原菌生长和发育，具有强烈的抑菌作用。由于它比天然产物硝吡咯菌素抗光解，广泛应用于防治农业生产中的真菌病害。氟啶胺(fluazinam)属2，6二硝基苯胺类保护性杀菌剂。是日本石原产业公司开发的杀菌剂，对灰霉病有特效。氟啶胺对交链孢属、葡萄孢属、疫霉属、单轴霉属、核盘菌属和黑垦菌属真菌有效，能够有效治理苯并咪唑类和二羧酰亚胺类杀菌剂的抗药性病原菌群体，兼有优良的控制食植性螨类的作用，对十字花科植物根肿病和根霉菌具有优异防效。苯醚甲环唑是属于三唑类化合物，能够有效防治葡萄炭疽病。杀菌谱广，可防治作物除卵菌和细菌病害外的多种真菌病害，有极高的杀菌活性；且持效期长，对植物还具有生长调节作用。对作物安全性高，持效期长，具有良好的保护作用，能够与套袋葡萄栽培技术要求相适应。目前，该病缺少有效的防治药剂，导致乱用药、滥用药[810]。因此，本文拟通过对现有药剂咯菌腈、氟啶胺和苯醚甲环唑的离体筛选，并建立敏感性基线，为该病的可持续防控奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
葡萄炭疽病菌，采集地点为江苏省镇江市句容葡萄产区。
1.1.2供试药剂
咯菌腈(98%)原药；氟啶胺(97.5%)原药；苯醚甲环唑(96.3%)原药。
1.2.1培养基的配制
PDA培养基：马铃薯200g , 琼脂15～20g , 葡萄糖20g , 最后定容至1000mL。
1.2.2药剂配制
将咯菌腈、氟啶胺、苯醚甲环唑原药分别溶于甲醇中，母液浓度均为10000μg/ml, 4℃冰箱中保存。
1.2.3梯度浓度药剂的制备
将咯菌腈母液稀释成10、100、1000、10000、100000μg/ml；氟啶胺母液稀释成6.25、12.5、25、50、100μg/ml；苯醚甲环唑母液稀释成250、500、1000、2000、4000μg/ml。
1.2.4菌株分离
将采集到的病果用次氯酸钠消毒后，蘸取病健分界处橙色菌落转接到培养基上25℃条件下培养35天后，挑取新鲜菌丝块转接到斜面试管培养基上25℃条件下培养3天后，放到4℃冰箱中保存。
1.3 葡萄炭疽病菌对不同类型杀菌剂的敏感性测定
1.3.1菌株活化
从保存菌种的试管中挑取菌丝块转接到PDA平板上，25℃培养5天。
1.3.2含药培养基的制作
微波炉融化PDA培养基，用量筒量取150ml培养基倒入无菌锥形瓶，加入上述三种杀菌剂原药的母液，分别制成含咯菌腈终浓度为0.01、0.1、1、10、100μg/ml, 氟啶胺终浓度为0.00625、0.0125、0. 25、0.05、0.1μg/ml, 苯醚甲环唑终浓度为0.25、0.5、1、2、4μg/ml。
1.3.3 毒力测定
采用菌丝生长速率法测定EC50。沿着活化好的病原菌菌落边缘打取5mm菌碟，转接到加有药剂的培养皿中，每个浓度三个重复，对照为不含药剂的培养皿。然后放到25℃培养箱中倒置培养5天，测定菌落直径。利用DPS软件中的毒力回归方程Y=a+bx计算药剂抑制菌丝生长的有效中浓度（EC50）作为毒力参数。
2结果与分析
2.1 葡萄炭疽病菌对咯菌腈、氟啶胺、苯醚甲环唑敏感性
根据葡萄炭疽病菌的菌丝生长对咯菌腈（表1）、氟啶胺（表2）、苯醚甲环唑（表3）三种杀菌剂敏感性，葡萄炭疽病菌对氟啶胺最敏感，咯菌腈次之，苯醚甲环唑表现最不敏感。因此，氟啶胺是防治葡萄炭疽病菌的候选药剂。以下是根据实验数据所计算得到的毒力方程。
表1葡萄炭疽病菌对咯菌腈的敏感性
菌株编号
毒力方程
相关系数
EC50
标准误
1
y=5.3774+0.5219x
0.9655
0.1892
目录
摘要1
关键词1
Abstract...1
Key words.1
前言2
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1供试菌株2
1.1.2 供试药剂..2
1.2 方法..2
1.2.1培养基的制备..2
1.2.2药剂制备2
1.2.3药剂浓度梯度设定2
1.2.4 菌株分离2
1.3 葡萄炭疽病对不同类型杀菌剂敏感性测定2
1.3.1 菌株活化2
1.3.2含药培养基制备2
1.3.3 毒力测定...3
2结果与分析....3
2.1葡萄炭疽病菌对咯菌腈、氟啶胺、苯醚甲环唑敏感性3
2.2 葡萄炭疽病菌对咯菌腈、氟啶胺、苯醚甲环唑敏感性基线的建立8
3讨论10
致谢11
参考文献12
葡萄炭疽病菌对咯菌腈、氟啶胺、苯醚甲环唑的敏感性基线建立
引言
葡萄炭疽病又称晚腐病，是由Colletotrichum gloeosporioides 引起的一种重要的常见病害，在全国葡萄主产区均有分布[12]，为害严重，给葡萄种植业的健康发展造成了严重的影响[34]。目前，我国南方产区该病发生较为普遍，有些年份发病非常严重；北方地区尤其是环渤海湾的酿酒葡萄产区炭疽病为害比较严重；西部地区几乎无葡萄炭疽病发生[5]。葡萄炭疽病主要为害着色期或近成熟期的果实，受害初期果粒上产生褐色圆形小斑点，后逐渐扩大凹陷产生轮纹状排列小黑点，潮湿天气病斑长出粉红色黏状物，严 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
重时病斑扩展至半个果粒，引起果粒腐烂[6]。由于缺少抗病品种，化学防控仍然是控制该病的主要方法[7]。咯菌腈（fludioxonil）是天然产物硝吡咯菌素（pyrrolnitrin）的类似物，作用于菌体MAPK途径中的渗透信号传导部分，进而抑制病原菌生长和发育，具有强烈的抑菌作用。由于它比天然产物硝吡咯菌素抗光解，广泛应用于防治农业生产中的真菌病害。氟啶胺(fluazinam)属2，6二硝基苯胺类保护性杀菌剂。是日本石原产业公司开发的杀菌剂，对灰霉病有特效。氟啶胺对交链孢属、葡萄孢属、疫霉属、单轴霉属、核盘菌属和黑垦菌属真菌有效，能够有效治理苯并咪唑类和二羧酰亚胺类杀菌剂的抗药性病原菌群体，兼有优良的控制食植性螨类的作用，对十字花科植物根肿病和根霉菌具有优异防效。苯醚甲环唑是属于三唑类化合物，能够有效防治葡萄炭疽病。杀菌谱广，可防治作物除卵菌和细菌病害外的多种真菌病害，有极高的杀菌活性；且持效期长，对植物还具有生长调节作用。对作物安全性高，持效期长，具有良好的保护作用，能够与套袋葡萄栽培技术要求相适应。目前，该病缺少有效的防治药剂，导致乱用药、滥用药[810]。因此，本文拟通过对现有药剂咯菌腈、氟啶胺和苯醚甲环唑的离体筛选，并建立敏感性基线，为该病的可持续防控奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
葡萄炭疽病菌，采集地点为江苏省镇江市句容葡萄产区。
1.1.2供试药剂
咯菌腈(98%)原药；氟啶胺(97.5%)原药；苯醚甲环唑(96.3%)原药。
1.2.1培养基的配制
PDA培养基：马铃薯200g , 琼脂15～20g , 葡萄糖20g , 最后定容至1000mL。
1.2.2药剂配制
将咯菌腈、氟啶胺、苯醚甲环唑原药分别溶于甲醇中，母液浓度均为10000μg/ml, 4℃冰箱中保存。
1.2.3梯度浓度药剂的制备
将咯菌腈母液稀释成10、100、1000、10000、100000μg/ml；氟啶胺母液稀释成6.25、12.5、25、50、100μg/ml；苯醚甲环唑母液稀释成250、500、1000、2000、4000μg/ml。
1.2.4菌株分离
将采集到的病果用次氯酸钠消毒后，蘸取病健分界处橙色菌落转接到培养基上25℃条件下培养35天后，挑取新鲜菌丝块转接到斜面试管培养基上25℃条件下培养3天后，放到4℃冰箱中保存。
1.3 葡萄炭疽病菌对不同类型杀菌剂的敏感性测定
1.3.1菌株活化
从保存菌种的试管中挑取菌丝块转接到PDA平板上，25℃培养5天。
1.3.2含药培养基的制作
微波炉融化PDA培养基，用量筒量取150ml培养基倒入无菌锥形瓶，加入上述三种杀菌剂原药的母液，分别制成含咯菌腈终浓度为0.01、0.1、1、10、100μg/ml, 氟啶胺终浓度为0.00625、0.0125、0. 25、0.05、0.1μg/ml, 苯醚甲环唑终浓度为0.25、0.5、1、2、4μg/ml。
1.3.3 毒力测定
采用菌丝生长速率法测定EC50。沿着活化好的病原菌菌落边缘打取5mm菌碟，转接到加有药剂的培养皿中，每个浓度三个重复，对照为不含药剂的培养皿。然后放到25℃培养箱中倒置培养5天，测定菌落直径。利用DPS软件中的毒力回归方程Y=a+bx计算药剂抑制菌丝生长的有效中浓度（EC50）作为毒力参数。
2结果与分析
2.1 葡萄炭疽病菌对咯菌腈、氟啶胺、苯醚甲环唑敏感性
根据葡萄炭疽病菌的菌丝生长对咯菌腈（表1）、氟啶胺（表2）、苯醚甲环唑（表3）三种杀菌剂敏感性，葡萄炭疽病菌对氟啶胺最敏感，咯菌腈次之，苯醚甲环唑表现最不敏感。因此，氟啶胺是防治葡萄炭疽病菌的候选药剂。以下是根据实验数据所计算得到的毒力方程。
表1葡萄炭疽病菌对咯菌腈的敏感性
菌株编号
毒力方程
相关系数
EC50
标准误
1
y=5.3774+0.5219x
0.9655
0.1892
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