一株食线虫内寄生真菌的鉴定及其生物学特性的研究
本文以一株分离自植物线虫体内的寄生真菌NKF 13222为研究对象，对其进行形态学及分子生物学鉴定，同时开展该菌株生物学特性的研究。形态学观察显示该菌株产生两种类型分生孢子梗，分别产生杆状和新月形两种类型分生孢子,且两种分生孢子的着生方式不同。结合β-tubulin基因片段和EF1-α基因片段序列比对结果，鉴定该真菌为食线虫内寄生真菌Esteya vermicola 。生物学性状研究表明营养丰富的PDA培养基更适合菌株NKF 13222的菌丝生长以及产生更多杆状孢子，营养匮乏的WA培养基上则产生更多的新月形孢子；菌株的适宜温度范围为20℃-30℃；菌株在PH为4.5-10.5的范围内均能生长。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1培养基及配方 2
1.1.2主要试剂与仪器2
1.2方法2
1.2.1 菌株NKF13222的形态学观察2
1.2．2 菌株NKF13222的分子生物学鉴定2
1.2．2．1 DNA的提取3
1.2．2．2 PCR扩增3
1.2.3 菌株NKF13222的生物学特性的研究3
1.2.3.1 营养条件对NKF13222生长的影响3
1.2.3.2 温度对NKF13222生长的影响3
1.2.3.3 PH对NKF13222生长的影响3
1.2.3.4 糖浓度对NKF13222生长的影响3
1.2.3.5 光暗条件对NKF13222生长的影响4
1.2.3.6 液体培养条件对NKF13222产孢量的影响4
2 结果与分析4
2.1菌株NKF13222的形态学特征4
2.2菌株NKF13222的分子鉴定5
2.3不同营养条件下菌株的生长情况6
2.4不同温度下菌株的生长情况7
2.5不同PH值下菌株的生长情况7
2.6不同糖浓度下菌株的生长情况8
2.7光暗条件 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
下菌株的生长情况8
3讨论 9
致谢9
参考文献10
一株食线虫内寄生真菌的鉴定及其生物学特性的研究
引言
植物寄生线虫是农作物、蔬菜、果树、林木、花卉及药材的重要病原生物之一，传播广泛，危害严重，常给农林业生产带来巨大的经济损失[1]，全球每年因植物病原线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元[2]。化学农药虽然对植物寄生线虫有良好的防治作用，但特效性差、易造成环境污染、农产品有农药残留、线虫会产生抗药性等缺点，因而采用生物防治是线虫病害防治的重要手段，是保护生态环境、实现农业可持续发展的有利保证[3]。食线虫真菌是动植物病害生物防治的重要研究材料，具有特殊的生态意义和经济价值，这类真菌也是自然界中线虫种群控制的重要因子[4]，因此利用食线虫真菌资源开发生物杀线虫剂的研究受到普遍重视。
林茂松等利用尖镰孢菌非致病菌株防治根结线虫，寄生率达到60%[5]。高学彪等发现利用淡紫拟青霉MCWA18菌株对南方根结线虫和爪哇根结线虫有很好的防治效果[6]。李洪连等成功的从小麦孢囊线虫孢囊上的寄生真菌中分离到11株对小麦孢囊线虫有较强寄生能力的真菌，防治效果达到50%[7]。Carneiro等利用厚垣普奇尼亚菌和淡紫拟青霉防治番石榴上的象耳豆根结线虫[8]。
本研究从莱诺尔夫线虫体内分离到一株线虫内寄生真菌NKF13222，初步研究显示该菌株对线虫有较强的寄生与致死能力，具有潜在的生防价值，为进一步开发和利用该菌株，本研究开展了对NKF13222菌株的形态学、分子生物学及生物学研究。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1培养基及配方
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）： 200g马铃薯，加适量水煮沸30min，四层纱布过滤，加入18g葡萄糖，17g琼脂，补足水量至1000 mL水，PH自然；
玉米粉琼脂培养基（CMA）：20g玉米粉，加水适量，微火煮沸30min，双层纱布过滤，冷却后加入琼脂粉15g，补足水量至1000ml，PH自然；
0.2%水琼脂培养基（WA）：20g琼脂，加水至1000 mL，PH自然；
马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）：200g马铃薯，加适量水煮沸30min，四层纱布过滤，加入18g葡萄糖，17g琼脂，补足水量至1000 mL水，PH自然；所有培养基按标准方法配制后高压蒸汽灭菌备用。
1.1.2 主要试剂与仪器
蛋白酶K、Taq聚合酶、2000bp ladder、Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯。
水平凝胶电泳装置，PCR热循环仪(eppendorf)，凝胶成像系统(BioRAD)，台式高速冷冻离心机(Heraeus)，电热恒温水浴锅，各种剂量移液枪等。
1.2 方法
1.2.1 菌株NKF13222的形态学观察
在载玻片上加入一滴水滴，用挑针挑取纯化后的NKF13222菌丝放入水滴中，盖上盖玻片，放入微分干涉显微镜（Olympus BX51, Tokyo, Japan）下拍照观察并描述菌株的形态特征。
将菌株NKF 13222分别在PDA和WA培养基上培养，每隔一段时间观察记录各培养基上菌株的菌落形成、菌丝、分生孢子产生情况等特征。
1.2．2 菌株NKF13222的分子生物学鉴定
1.2．2．1 DNA的提取
将活化的菌丝从长满培养基的平板上直接刮区下来，收集菌丝于研钵中，加入液氮，用研磨棒用力研磨，立即转移至1.5ml EP管中。加入600ul Buffer FG1，充分涡旋，65℃温育10min，并上下颠倒两次。加入140ul Buffer FG2，涡旋混匀，10000r/min离心10min。吸出上清液至新的1.5ml EP管，加入0.7倍上清液体积的异丙醇，涡旋以沉淀DNA，立即10000r/min离心2min。小心吸出上清液，弃上清液。加入300ul 事先加热至65℃的灭菌去离子水，涡旋，简短温育65℃后加入4ul RNase，混匀。加入150ul的Buffer FG3，再加入300ul的乙醇，涡旋至获得澄清混合物。将DNA管放入2ml收集管中，将整个样品转移至DNA管中，10000r/min离心1min，弃滤液和2ml收集管。将DNA管转移至新的2ml收集管中，加入700ul DNA Wash Buffer，10000r/min离心1min，弃滤液，并再重复此步骤一次。空管离心2min后将空管转移至1.5ml EP管中，加入100ul Elution Buffer，室温下放置23min，10000r/min离心1min洗脱DNA。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1培养基及配方 2
1.1.2主要试剂与仪器2
1.2方法2
1.2.1 菌株NKF13222的形态学观察2
1.2．2 菌株NKF13222的分子生物学鉴定2
1.2．2．1 DNA的提取3
1.2．2．2 PCR扩增3
1.2.3 菌株NKF13222的生物学特性的研究3
1.2.3.1 营养条件对NKF13222生长的影响3
1.2.3.2 温度对NKF13222生长的影响3
1.2.3.3 PH对NKF13222生长的影响3
1.2.3.4 糖浓度对NKF13222生长的影响3
1.2.3.5 光暗条件对NKF13222生长的影响4
1.2.3.6 液体培养条件对NKF13222产孢量的影响4
2 结果与分析4
2.1菌株NKF13222的形态学特征4
2.2菌株NKF13222的分子鉴定5
2.3不同营养条件下菌株的生长情况6
2.4不同温度下菌株的生长情况7
2.5不同PH值下菌株的生长情况7
2.6不同糖浓度下菌株的生长情况8
2.7光暗条件 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
下菌株的生长情况8
3讨论 9
致谢9
参考文献10
一株食线虫内寄生真菌的鉴定及其生物学特性的研究
引言
植物寄生线虫是农作物、蔬菜、果树、林木、花卉及药材的重要病原生物之一，传播广泛，危害严重，常给农林业生产带来巨大的经济损失[1]，全球每年因植物病原线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元[2]。化学农药虽然对植物寄生线虫有良好的防治作用，但特效性差、易造成环境污染、农产品有农药残留、线虫会产生抗药性等缺点，因而采用生物防治是线虫病害防治的重要手段，是保护生态环境、实现农业可持续发展的有利保证[3]。食线虫真菌是动植物病害生物防治的重要研究材料，具有特殊的生态意义和经济价值，这类真菌也是自然界中线虫种群控制的重要因子[4]，因此利用食线虫真菌资源开发生物杀线虫剂的研究受到普遍重视。
林茂松等利用尖镰孢菌非致病菌株防治根结线虫，寄生率达到60%[5]。高学彪等发现利用淡紫拟青霉MCWA18菌株对南方根结线虫和爪哇根结线虫有很好的防治效果[6]。李洪连等成功的从小麦孢囊线虫孢囊上的寄生真菌中分离到11株对小麦孢囊线虫有较强寄生能力的真菌，防治效果达到50%[7]。Carneiro等利用厚垣普奇尼亚菌和淡紫拟青霉防治番石榴上的象耳豆根结线虫[8]。
本研究从莱诺尔夫线虫体内分离到一株线虫内寄生真菌NKF13222，初步研究显示该菌株对线虫有较强的寄生与致死能力，具有潜在的生防价值，为进一步开发和利用该菌株，本研究开展了对NKF13222菌株的形态学、分子生物学及生物学研究。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1培养基及配方
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）： 200g马铃薯，加适量水煮沸30min，四层纱布过滤，加入18g葡萄糖，17g琼脂，补足水量至1000 mL水，PH自然；
玉米粉琼脂培养基（CMA）：20g玉米粉，加水适量，微火煮沸30min，双层纱布过滤，冷却后加入琼脂粉15g，补足水量至1000ml，PH自然；
0.2%水琼脂培养基（WA）：20g琼脂，加水至1000 mL，PH自然；
马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）：200g马铃薯，加适量水煮沸30min，四层纱布过滤，加入18g葡萄糖，17g琼脂，补足水量至1000 mL水，PH自然；所有培养基按标准方法配制后高压蒸汽灭菌备用。
1.1.2 主要试剂与仪器
蛋白酶K、Taq聚合酶、2000bp ladder、Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯。
水平凝胶电泳装置，PCR热循环仪(eppendorf)，凝胶成像系统(BioRAD)，台式高速冷冻离心机(Heraeus)，电热恒温水浴锅，各种剂量移液枪等。
1.2 方法
1.2.1 菌株NKF13222的形态学观察
在载玻片上加入一滴水滴，用挑针挑取纯化后的NKF13222菌丝放入水滴中，盖上盖玻片，放入微分干涉显微镜（Olympus BX51, Tokyo, Japan）下拍照观察并描述菌株的形态特征。
将菌株NKF 13222分别在PDA和WA培养基上培养，每隔一段时间观察记录各培养基上菌株的菌落形成、菌丝、分生孢子产生情况等特征。
1.2．2 菌株NKF13222的分子生物学鉴定
1.2．2．1 DNA的提取
将活化的菌丝从长满培养基的平板上直接刮区下来，收集菌丝于研钵中，加入液氮，用研磨棒用力研磨，立即转移至1.5ml EP管中。加入600ul Buffer FG1，充分涡旋，65℃温育10min，并上下颠倒两次。加入140ul Buffer FG2，涡旋混匀，10000r/min离心10min。吸出上清液至新的1.5ml EP管，加入0.7倍上清液体积的异丙醇，涡旋以沉淀DNA，立即10000r/min离心2min。小心吸出上清液，弃上清液。加入300ul 事先加热至65℃的灭菌去离子水，涡旋，简短温育65℃后加入4ul RNase，混匀。加入150ul的Buffer FG3，再加入300ul的乙醇，涡旋至获得澄清混合物。将DNA管放入2ml收集管中，将整个样品转移至DNA管中，10000r/min离心1min，弃滤液和2ml收集管。将DNA管转移至新的2ml收集管中，加入700ul DNA Wash Buffer，10000r/min离心1min，弃滤液，并再重复此步骤一次。空管离心2min后将空管转移至1.5ml EP管中，加入100ul Elution Buffer，室温下放置23min，10000r/min离心1min洗脱DNA。
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