利用关联分析挖掘大豆裂荚性状的新基因
作物果实的发育与成熟是高等植物生长发育过程中最重要的环节，与作物产量和农产品的质量关系密切，进一步会影响经济效益。在收获时，裂荚是影响大豆产量的一个重要因素。认识大豆裂荚的分子机制有利于减少大豆的裂荚率，进而提高大豆的整体产量。现有的科学研究已经取得了显著积累。为了进一步挖掘大豆裂荚的新基因，本课题利用关联分析的方法挖掘控制大豆裂荚性状的新基因，采用Q+K模型对来自不同区域的219份栽培大豆群体田间裂荚与1142个SNP标记进行全基因组的关联分析。用1142个SNP标记进行全基因组的扫描，共检测到10个SNP标记，这些标记主要位于2、3、8、9、10、14、16、18和19号染色体上。关键字关联分析；大豆裂荚；新基因Identification of new genes of soybean pod dehiscence by association analysisStudent majoring in Agronomy ZhangqiuyuTutor HuangfangAbstract: Crop of fruit development and maturity is the most important process for higher plant growth and development aspects in the close relationship with the quality of crops and agricultural products, further affects the economic benefit. At harvest, pod dehiscence is one of the important factors affecting the yield of soybean. Understanding the molecular mechanism of soybean pod is beneficial to reduce the pod yield and increase the total yield of soybean. The existing scientific research has gained remarkable accumulation. In order to
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further tap the gene of soybean pod dehiscence. The subject of the use of correlation analysis method mining gene of soybean pod dehiscence. The q model of a population of cultivated soybean field splitting pods and 1142 SNP markers for genome-wide association analysis. The whole genome scan with 1142 SNP markers, 10 SNP markers were detected, these markers are mainly located in the 2, 3, 8, 9, 10, 14, 16, 18 and 19 chromosomes. 种子落粒性是一种野生植物中常见的的种子散落和自身繁殖的机制。在大豆收获时，荚的开裂是影响大豆产量的一个重要因素。荚果是由子房发育而来的果实，由通过背缝线和腹缝线相互连接的2 个单心皮组成。当荚果的水分含量相对较低时，荚的内生厚壁组织层细胞的张力不同，荚皮围绕着与内生后壁组织层的纤维方向平行的轴呈螺旋的扭转而卷曲，将连接背、腹缝线的薄壁组织拉裂，荚皮开裂。认识荚开裂的分子机制可以有利于耐裂品种的选育进而提高整体大豆产量，加快优良农艺性状从野生种到栽培育种品系的渗入，并且帮助我们理解对种子进化和驯化过程的理解。为了探索大豆荚开裂性的遗传基础，利用来自不同区域的219份栽培大豆构成的自然群体进行关联分析的方法进行大豆裂荚性状的定位。基于大豆裂荚这一性状在农业生产和驯化研究上的重要性，进一步研究大豆裂荚的分子机制开展本课题。1 课题背景1.1本课题研究意义豆类在全球作物生产中占27％，位居第二，在全球作物生产中占有重要地位。大部分作物豆类种植是为了收获其营养丰富的种子，豆科植物的种子被包含在荚中，当成熟时荚沿着两条接缝开裂，这个过程被称为豆荚开裂或豆荚破碎。荚在收获之前或期间开裂将会导致粮食豆类的产量损失。认识荚开裂的分子机制可以有利于耐裂品种的选育进而提高整体大豆产量，加快优良农艺性状从野生种到栽培育种品系的渗入，并且帮助我们对种子进化和驯化过程的理解[1]1.2国内外研究概况大豆基因组的研究资源已经在过去十年中取得了显著的积累。许多已经被发现的DNA标记被分配到高密度的分子连锁图谱中[2]。超过12万的表达序列标签（EST）随着全长cDNA文库信息被公布[3]。最后大豆基因组初步完整的序列被公布[4]，可以为我们对大豆产量相关性状进行初定位提供重要工具。野生大豆通过荚果开裂分散其种子，目前种植的许多品种的大豆是由野生大豆品种经过长期的人工驯化而来。产量高、荚果开裂少、抗虫抗病、抵抗生物或非生物胁迫等有利性状被保留下来，从而增加生物产量，提高经济效益。然而，在大豆品系间开裂抗性方面有着非常显著的基因型差异[5]。抗裂性在一些大豆大规模种植的地区包括北美已经被引入到一些先进品种中[6]，然而其他地区的大豆裂荚问题仍然没有得到解决。1.2.1主效QTL的鉴定一般认为，大豆是由野生品种驯化而来的。野生品种通常具有农艺上有益基因，如抵抗生物和非生物胁迫，然而野生大豆的显性和定量遗传的落粒性状基因是有效渗入到栽培品种中的限制因素。利用分子标记的高效选择性，许多研究已经完成了对荚落粒性状抗性的QTL的鉴定。Bailey等首先确定了与限制性片段长度多态性标记B122-1相连的连锁群（LG）J（16号染色体）上的一个主效QTL[6]。该QTL的存在后来被证实并精细定位。这个QTL，称为qPDH1，占表型变异的50％[6] 。数量性状位点（QTL）分析已经在从感裂性和抗裂性栽培品种杂交得到的重组自交系（RIL）中进行[7]。在这些研究中，主效QTL紧密相互定位到16号染色体上（原连锁群J），它们可能是相同的位点[7]。命名为qPDH1的主效QTL，被发现是位于简单重复序列（SSR）标记Sat_093和Sat_366之间[7]。此外，qPDH1抗裂性等位基因在不同遗传背景的多个位置处证明是有益的[7]。1.2.2主效QTL的重要性受qPDH1调节的荚果开裂性机制的阐发对农艺以及植物科学有重要意义。Tsuchiya比较了不同开裂程度的品种间的荚果的形态[5] 。他发现在敏感和抗性品种之间荚果宽度与厚度之比有着显著差异，尽管性状如何与荚果开裂相关联还是未知的。另外，他还发现感裂性和抗裂性品种间荚果开裂区的形态不同。Tiwari 和Bhatia的研究也集中在开裂区胚座框的形态，解剖分析表明，束帽的长度和厚度和荚果开裂的程度相关联[8]。然而，由于研究中使用的品种在许多特性包括荚开裂方面是不同的，观察到的形态变化与荚开裂的直接联系仍然不清楚。1.3关联分析关联分析，也称关联作图或连锁不平衡作图，是以连锁不平衡为基础，鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因的关联，是一种高效定位QTL的分析方法。根据关联分析的目标和研究群体的连锁不平衡(LD)水平，可将关联分析分为全基因组关联分析和候选基因关联分析。关联分析是利用标记与QTL等位基因间的LD水平来定位QTL, 当选取的标记数量能够覆盖全基因组片段时, 就可以定位到所有影响表型的QTL, 此种定位QTL的策略称为基于全基因组途径扫描的关联分析[9]。候选基因关联分析是通过对候选基因测序并鉴定序列水平多态性，最后通过统计分析来鉴定候选基因多态位点对表型的贡献。采用哪种关联分析方法，决定于所研究群体的大小和群体内的LD水平。1.3.1关联分析的应用现状在植物中进行关联分析为现有双亲群体中的QTL定位与克隆和转基因的方法起了一个强大的互补作用。它已在几乎所有主要的作物品种中被广泛采用用来基因鉴定和QTL验证，并更好地为了解复杂性状提供了遗传基础[10]。在这些研究中, 大部分均利用了候选基因的方法, 选择的候选基因主要是生理生化途径中关键的功能基因、QTL研究定位区域中所含的基因和近缘物种研究中表明效应值比较大的同源基因等[9]。关联分析的一个主要好处是捕获到许多不同性状的多样性。不同于某些性状存在差异的具体亲本群体，大多数组合的关联分析群体可以用于许多性状研究，因此可以从不同的方面进行研究包括植物结构、生长、农艺性状、适应特征和营养价值。1.3.2关联分析的应用展望近年来, 随着新的统计分析方法的发展, 关联分析逐步提高了分析的功效, 使得关联分析方法学日趋完善。随着基因型分析技术的飞速发展, 特别是高通量测序技术发展, 关联分析一定会在植物遗传学研究中发挥更为关键的作用。作物的许多重要的农艺性状, 如产量、营养品质和抗逆性等多属数量性状, 利用常规育种的方法通常效率不高,采用分子育种技术育种是未来的发展方向。关联分析作为一种高效的QTL定位工具, 可在分子育种中发挥关键的作用。2 材料与方法2.1供试材料大豆（Glycine max (L.) Merr.）材料是由大学国家大豆改良中心种质资源研究室提供，包括来自不同区域的219份栽培大豆，本试验用的材料是混合材料，该群体栽培大豆选自全国各地包括地方品种和育成品种以及国外品种。本试验中所有材料在南京和南通试点均能正常完成生命周期。2.2试验设计及性状测定本试验采用完全随机区组设计，三个区组，每个材料4行，行长为2m，行间距50cm，每行均在出苗后两周左右定苗至20株[11]。在大豆生育期内，田间管理同一般大田生产，以确保降低灌溉、病虫害、杂草等因素对材料的影响。2.3性状测定性状测定均是在大豆成熟之后，每个材料随机取5株，每株取20个荚，共三个重复，取荚放入纸袋中在60℃干燥箱内处理三个小时后进行裂荚统计，性状测定方法参考Funatsuki研究[7]。2.4表型数据分析对群体进行基本统计量的描述性分析，包括平均值、标准差、最大值、最小值、极差、中位数、标准误分析。对群体进行方差分析。所有表性数据均值R上进行计算。自然群体栽培大豆的群体结构、连锁不平衡估算、多样性分析和材料之间的亲缘关系分析参照胡振宾博士论文[12]。父母本的单株有效荚数和百粒重有极显著差异，单株粒重有显著差异。这为荚粒性状的检测提供了良好的遗传背景。不同世代各家系间表型值均呈连续性分布，并存在不同程度的表型变异，杂交后代群体的表型变异范围大，变异范围随着世代的增加而减小。2.5关联分析本研究以219份栽培大豆群体为材料，于2015年在南京进行。利用覆盖全基因组的1142个SNP标记对群体进行了进行定位。利用TASSEL2.1软件鉴定与大豆裂荚性显著相关的SSR位点，显著性阈值为-LogP≥2(P≤0.01)则认为标记与表型关联。本试验中用到的分子标记是由Choi等开发，基于混合线性模型（MLM,Q+K）进行关联分析，将群体结构Q作为协变量，K矩阵作为固定效应，从而检测影响裂荚性的QTL，为大豆分子标记辅助选择育种提供基础。3 结果与分析3.1群体结构参考郝德荣和胡振宾的博士论文[13－14]，为了减少群体结构的影响，采用STRUCTURE分析自然群体结构，将该群体划分为两个亚群，其中一个亚群材料主要源于华北生态区、熟期较早，另一个亚群材料主要来源于华南生态区，熟期较晚。3.2表型数据分析本研究对219份栽培大豆群体裂荚率，用进行了描述性统计、方差分析和广义遗传率估算，在栽培豆中平均变化幅度为2015年为0-0.98， 2015年平均裂荚率分别为0.26。 对裂荚性状自然群体的基本统计量（表1）显示裂荚性状在两年环境中存在广泛的显著变异品种间差异也是极显著的。裂荚率最小值为0，最大值为0.99，极差为0.99，品种之间裂荚性状较大。裂荚率的平均水平为0.26，中位数为0.1，反应出裂荚率出现在最中间位置的数是0.1，中位数小于平均数。表1 栽培大豆群体裂荚性状的基本统计量描述性分析Table 1 Descriptive statistics of soybean pod trait of cultivated soybean性状Traits年份Year平均值Mean标准差Sd中位数Median最小值Max最大值Min 极差Range偏差Skew峰度Kuitosis标准误Se裂荚率20150.260.310.100.990.990.97-0.560.02对栽培大豆群体裂荚性状的方差分析和广义遗传力的分析（表2）显示，遗传力值为50.7％，表明裂荚性状同时受到遗传和环境相互作用的影响。表2 栽培大豆群体裂荚性状方差分析及广义遗传力性状Traits变异因素Factors自由度Df平方和Sum sq均方Mean sqF值F valueP值Pr(>P)显著性Sig遗传力Heribility裂荚率Line218160.790.73819.894<2e-16***50.7Year127.1727.168732.756<2e-16***Line:Year21836.120.1664.469<2e-16***Year:Rep10.030.0260.7060.401Residuals218981.160.037Table 2 ANOVA and Broad heritability(h2) of soybean pod dehiscencetraits of cultivated soybean3.3关联分析结果为了减少群体结构和遗传亲缘关系产生的影响，采用Q+K模型对栽培豆群体田间裂荚与1142个SNP标记进行全基因组的关联分析，找出与大豆裂荚率相关的SNP位点(表3)。利用TASSEL2.1软件对1142个SNP标记进行全基因组的扫描（P<0.01），共检测到10个SNP标记，这些标记主要位于2、3、8、9、10、14、16、18和19号染色体上，为挖掘裂荚相关基因提供了参考依据。表3 与大豆裂荚率关联的SNP位点Table 3 SNPs associated with soybean pod dehiscence 性状年份标记染色体位置F值P值裂荚率2015BARC-020045-044202478020324.8183720.00911052BARC-030669-069203471608294.728730.00992163BARC-044051-08595831747544.9309110.00818634BARC-021551-041419363825915.1250270.00683863BARC-025959-051851033705177.8040020.0057558BARC-016773-0231710385233226.8900990.0093843BARC-028723-059981421858775.5542260.0045444BARC-039625-0752316320999774.9900130.00773954BARC-041855-081101847424585.3071570.0057302BARC-017027-0217919446418417.0951430.00840025由于品种间的裂荚特性的差异，大豆裂荚率的离散程度(图1)并未显示出明显的关联关系。 图1 裂荚率的离散程度Figure 1 The rate of crack pod degree of dispersion根据田间裂荚率值全基因组关联分析结果的曼哈顿图和QQ图(图2)，在曼哈顿图中取阈值大于2的为显著关联到的SNP位点，QQ图显示出关联分析的准确性。 图2 田间裂荚率值全基因组关联分析结果的曼哈顿图和QQ图Figure 2 Manhattan and QQ plot of Genome wide association analysis for based on pod dehiscence对栽培大豆裂荚的频率分布显示裂荚率集中在0.15以下(如图3)。图3 栽培大豆裂荚的频率分布Figure 3 The frequency distribution of pod dehiscence of cultivated soybean 4 讨论通过运用分子标记的高效选择性，荚落粒性状抗性的QTL已被许多研究鉴定。Bailey等首先确定了一个主效QTL[6]，该主效QTL位点与限制性片段长度多态性标记B122-1的连锁群（LG）J（16号染色体）相连。该QTL的存在后来被证实，Funatsuki将该主效QTL精细定位[7]。在这些研究中，主效QTL紧密连锁定位到16号染色体上（原连锁群J），它们可能是相同的位点。被命名为qPDH1的主效QTL，被发现是位于SSR标记Sat_093和Sat_366之间[7]。公开的裂荚性状和初次定位的重组自交系被Muqiang Gao等用于对qPDH1进行精细定位[15]。这个重组自交系来源于抗裂性品种Young和易裂性品种PI416937。研究基于一个假设qPDH1没有强的上位性互作，极度易裂的重组自交系将保持母本PI416937的单倍型（由Sat_093和Sat_366标记划定）。如果假设成立，极度抗裂性的重组自交系将大部分保留Young的单倍型，并且这两个标记间的重组事件将有利于把qPDH1定位到更小的遗传距离内。Q+K模型广泛应用于基因组的关联分析。本研究采用Q+K模型对栽培大豆群体田间裂荚与1142个SNP标记进行全基因组的关联分析。用1142个SNP标记进行全基因组的扫描（P<0.01），共检测到10个SNP标记，这些标记主要位于2、3、8、9、10、14、16、18和19号染色体上。运用Q+K混合模型和P+K混合模型均能够较好的去除关联分析时由于群体分层引起的假阳性。通过比较分析发现，Q+K混合模型的效率最高，该模型可以更好的校正群体结构控制假阳性。大豆裂荚性状属于较为复杂的农艺性状，其表现是基因型与环境型互作的结果，同时受到很多因素的影响。遗传条件的不同可能会导致同一形状的表现存在较大差异，同样的，环境条件不同，年份不同，也会使得同一基因型的检测结果不同。温度、空气相对湿度、品种间差异、基因型等因素都会影响到大豆裂荚。本研究只是一年的数据，需要多年多点的实验验证结果的可靠性。致 谢首先，本文在导师黄方教授悉心指导不倦教诲下完成，谨向导师表示衷心的感谢。黄方教授从论文的选题、试验方案设计与落实实施、数据整理到论文写作都给予了悉心的指导。她严谨周密的治学态度、讲求实效的工作作风、渊博精深的学术造诣、对问题的敏锐洞察力、高度的责任心以及和蔼可亲的学者风度给我留下了深刻的印象，使我受益匪浅。同时，感谢一起学习的同学们，特别感谢王婷婷师姐的大力支持和热情帮助，在此谨表谢意。最后，再次感谢所有在学习和生活中帮助过我的人，谢谢！ 张 秋 雨 2016年3月于南京参考文献[1] 孙东凤, 康玉凡.大豆炸荚性研究进展[J].大豆科学, 2011, 30(6):1030-1034.[2] Cregan PB, Jarvik T, Bush AL, Shoemaker RC, Lark KG, Kahler AL, Kaya N, Van Toai TT, Lohnaes DG, Chung T, Specht JE. 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目录
摘要................................................................1
关键词..............................................................1
Abstract............................................................1
Key words...........................................................1
引言（或绪论)........................................................1
1课题背景..........................................................2
1.1本课题研究意义..................................................2
1.2国内外研究概况..................................................2
1.2.1主效QTL的鉴定................................................2
1.2.2主效QTL的重要性..............................................2
1.3关联分析........................................................3
1.3.1关联分析的应用现状............................................3
1.3.2关联分析的应用展望............................................3
2材料与方法........................................................3
2.1供试材料........................................................3
2.2试验设计及性状测定材料..........................................4
2.3性状测定........................................................4
2.4表型数据分析....................................................4
2.5关联分析........................................................4
3结果与分析........................................................4
3.1群体结构........................................................4
3.2表型数据分析....................................................4
3.3关联分析结果....................................................5
4讨论..............................................................7
致谢................................................................7
参考文献............................................................8
表1 栽培大豆群体裂荚性状的基本统计量描述性分析....................5
表2 栽培大豆群体裂荚性状的方差分析及广义遗传力....................5
表3 与大豆裂荚相关的SNP位点.... ..................................5
图1 裂荚率的离散程度 ..............................................6
图2 田间裂荚率值全基因组关联分析结果的曼哈顿图和QQ图.............6
图2 栽培大豆裂荚的频率分布........................................7
利用关联分析挖掘大豆裂荚性状的新基因
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
further tap the gene of soybean pod dehiscence. The subject of the use of correlation analysis method mining gene of soybean pod dehiscence. The q model of a population of cultivated soybean field splitting pods and 1142 SNP markers for genome-wide association analysis. The whole genome scan with 1142 SNP markers, 10 SNP markers were detected, these markers are mainly located in the 2, 3, 8, 9, 10, 14, 16, 18 and 19 chromosomes. 种子落粒性是一种野生植物中常见的的种子散落和自身繁殖的机制。在大豆收获时，荚的开裂是影响大豆产量的一个重要因素。荚果是由子房发育而来的果实，由通过背缝线和腹缝线相互连接的2 个单心皮组成。当荚果的水分含量相对较低时，荚的内生厚壁组织层细胞的张力不同，荚皮围绕着与内生后壁组织层的纤维方向平行的轴呈螺旋的扭转而卷曲，将连接背、腹缝线的薄壁组织拉裂，荚皮开裂。认识荚开裂的分子机制可以有利于耐裂品种的选育进而提高整体大豆产量，加快优良农艺性状从野生种到栽培育种品系的渗入，并且帮助我们理解对种子进化和驯化过程的理解。为了探索大豆荚开裂性的遗传基础，利用来自不同区域的219份栽培大豆构成的自然群体进行关联分析的方法进行大豆裂荚性状的定位。基于大豆裂荚这一性状在农业生产和驯化研究上的重要性，进一步研究大豆裂荚的分子机制开展本课题。1 课题背景1.1本课题研究意义豆类在全球作物生产中占27％，位居第二，在全球作物生产中占有重要地位。大部分作物豆类种植是为了收获其营养丰富的种子，豆科植物的种子被包含在荚中，当成熟时荚沿着两条接缝开裂，这个过程被称为豆荚开裂或豆荚破碎。荚在收获之前或期间开裂将会导致粮食豆类的产量损失。认识荚开裂的分子机制可以有利于耐裂品种的选育进而提高整体大豆产量，加快优良农艺性状从野生种到栽培育种品系的渗入，并且帮助我们对种子进化和驯化过程的理解[1]1.2国内外研究概况大豆基因组的研究资源已经在过去十年中取得了显著的积累。许多已经被发现的DNA标记被分配到高密度的分子连锁图谱中[2]。超过12万的表达序列标签（EST）随着全长cDNA文库信息被公布[3]。最后大豆基因组初步完整的序列被公布[4]，可以为我们对大豆产量相关性状进行初定位提供重要工具。野生大豆通过荚果开裂分散其种子，目前种植的许多品种的大豆是由野生大豆品种经过长期的人工驯化而来。产量高、荚果开裂少、抗虫抗病、抵抗生物或非生物胁迫等有利性状被保留下来，从而增加生物产量，提高经济效益。然而，在大豆品系间开裂抗性方面有着非常显著的基因型差异[5]。抗裂性在一些大豆大规模种植的地区包括北美已经被引入到一些先进品种中[6]，然而其他地区的大豆裂荚问题仍然没有得到解决。1.2.1主效QTL的鉴定一般认为，大豆是由野生品种驯化而来的。野生品种通常具有农艺上有益基因，如抵抗生物和非生物胁迫，然而野生大豆的显性和定量遗传的落粒性状基因是有效渗入到栽培品种中的限制因素。利用分子标记的高效选择性，许多研究已经完成了对荚落粒性状抗性的QTL的鉴定。Bailey等首先确定了与限制性片段长度多态性标记B122-1相连的连锁群（LG）J（16号染色体）上的一个主效QTL[6]。该QTL的存在后来被证实并精细定位。这个QTL，称为qPDH1，占表型变异的50％[6] 。数量性状位点（QTL）分析已经在从感裂性和抗裂性栽培品种杂交得到的重组自交系（RIL）中进行[7]。在这些研究中，主效QTL紧密相互定位到16号染色体上（原连锁群J），它们可能是相同的位点[7]。命名为qPDH1的主效QTL，被发现是位于简单重复序列（SSR）标记Sat_093和Sat_366之间[7]。此外，qPDH1抗裂性等位基因在不同遗传背景的多个位置处证明是有益的[7]。1.2.2主效QTL的重要性受qPDH1调节的荚果开裂性机制的阐发对农艺以及植物科学有重要意义。Tsuchiya比较了不同开裂程度的品种间的荚果的形态[5] 。他发现在敏感和抗性品种之间荚果宽度与厚度之比有着显著差异，尽管性状如何与荚果开裂相关联还是未知的。另外，他还发现感裂性和抗裂性品种间荚果开裂区的形态不同。Tiwari 和Bhatia的研究也集中在开裂区胚座框的形态，解剖分析表明，束帽的长度和厚度和荚果开裂的程度相关联[8]。然而，由于研究中使用的品种在许多特性包括荚开裂方面是不同的，观察到的形态变化与荚开裂的直接联系仍然不清楚。1.3关联分析关联分析，也称关联作图或连锁不平衡作图，是以连锁不平衡为基础，鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因的关联，是一种高效定位QTL的分析方法。根据关联分析的目标和研究群体的连锁不平衡(LD)水平，可将关联分析分为全基因组关联分析和候选基因关联分析。关联分析是利用标记与QTL等位基因间的LD水平来定位QTL, 当选取的标记数量能够覆盖全基因组片段时, 就可以定位到所有影响表型的QTL, 此种定位QTL的策略称为基于全基因组途径扫描的关联分析[9]。候选基因关联分析是通过对候选基因测序并鉴定序列水平多态性，最后通过统计分析来鉴定候选基因多态位点对表型的贡献。采用哪种关联分析方法，决定于所研究群体的大小和群体内的LD水平。1.3.1关联分析的应用现状在植物中进行关联分析为现有双亲群体中的QTL定位与克隆和转基因的方法起了一个强大的互补作用。它已在几乎所有主要的作物品种中被广泛采用用来基因鉴定和QTL验证，并更好地为了解复杂性状提供了遗传基础[10]。在这些研究中, 大部分均利用了候选基因的方法, 选择的候选基因主要是生理生化途径中关键的功能基因、QTL研究定位区域中所含的基因和近缘物种研究中表明效应值比较大的同源基因等[9]。关联分析的一个主要好处是捕获到许多不同性状的多样性。不同于某些性状存在差异的具体亲本群体，大多数组合的关联分析群体可以用于许多性状研究，因此可以从不同的方面进行研究包括植物结构、生长、农艺性状、适应特征和营养价值。1.3.2关联分析的应用展望近年来, 随着新的统计分析方法的发展, 关联分析逐步提高了分析的功效, 使得关联分析方法学日趋完善。随着基因型分析技术的飞速发展, 特别是高通量测序技术发展, 关联分析一定会在植物遗传学研究中发挥更为关键的作用。作物的许多重要的农艺性状, 如产量、营养品质和抗逆性等多属数量性状, 利用常规育种的方法通常效率不高,采用分子育种技术育种是未来的发展方向。关联分析作为一种高效的QTL定位工具, 可在分子育种中发挥关键的作用。2 材料与方法2.1供试材料大豆（Glycine max (L.) Merr.）材料是由大学国家大豆改良中心种质资源研究室提供，包括来自不同区域的219份栽培大豆，本试验用的材料是混合材料，该群体栽培大豆选自全国各地包括地方品种和育成品种以及国外品种。本试验中所有材料在南京和南通试点均能正常完成生命周期。2.2试验设计及性状测定本试验采用完全随机区组设计，三个区组，每个材料4行，行长为2m，行间距50cm，每行均在出苗后两周左右定苗至20株[11]。在大豆生育期内，田间管理同一般大田生产，以确保降低灌溉、病虫害、杂草等因素对材料的影响。2.3性状测定性状测定均是在大豆成熟之后，每个材料随机取5株，每株取20个荚，共三个重复，取荚放入纸袋中在60℃干燥箱内处理三个小时后进行裂荚统计，性状测定方法参考Funatsuki研究[7]。2.4表型数据分析对群体进行基本统计量的描述性分析，包括平均值、标准差、最大值、最小值、极差、中位数、标准误分析。对群体进行方差分析。所有表性数据均值R上进行计算。自然群体栽培大豆的群体结构、连锁不平衡估算、多样性分析和材料之间的亲缘关系分析参照胡振宾博士论文[12]。父母本的单株有效荚数和百粒重有极显著差异，单株粒重有显著差异。这为荚粒性状的检测提供了良好的遗传背景。不同世代各家系间表型值均呈连续性分布，并存在不同程度的表型变异，杂交后代群体的表型变异范围大，变异范围随着世代的增加而减小。2.5关联分析本研究以219份栽培大豆群体为材料，于2015年在南京进行。利用覆盖全基因组的1142个SNP标记对群体进行了进行定位。利用TASSEL2.1软件鉴定与大豆裂荚性显著相关的SSR位点，显著性阈值为-LogP≥2(P≤0.01)则认为标记与表型关联。本试验中用到的分子标记是由Choi等开发，基于混合线性模型（MLM,Q+K）进行关联分析，将群体结构Q作为协变量，K矩阵作为固定效应，从而检测影响裂荚性的QTL，为大豆分子标记辅助选择育种提供基础。3 结果与分析3.1群体结构参考郝德荣和胡振宾的博士论文[13－14]，为了减少群体结构的影响，采用STRUCTURE分析自然群体结构，将该群体划分为两个亚群，其中一个亚群材料主要源于华北生态区、熟期较早，另一个亚群材料主要来源于华南生态区，熟期较晚。3.2表型数据分析本研究对219份栽培大豆群体裂荚率，用进行了描述性统计、方差分析和广义遗传率估算，在栽培豆中平均变化幅度为2015年为0-0.98， 2015年平均裂荚率分别为0.26。 对裂荚性状自然群体的基本统计量（表1）显示裂荚性状在两年环境中存在广泛的显著变异品种间差异也是极显著的。裂荚率最小值为0，最大值为0.99，极差为0.99，品种之间裂荚性状较大。裂荚率的平均水平为0.26，中位数为0.1，反应出裂荚率出现在最中间位置的数是0.1，中位数小于平均数。表1 栽培大豆群体裂荚性状的基本统计量描述性分析Table 1 Descriptive statistics of soybean pod trait of cultivated soybean性状Traits年份Year平均值Mean标准差Sd中位数Median最小值Max最大值Min 极差Range偏差Skew峰度Kuitosis标准误Se裂荚率20150.260.310.100.990.990.97-0.560.02对栽培大豆群体裂荚性状的方差分析和广义遗传力的分析（表2）显示，遗传力值为50.7％，表明裂荚性状同时受到遗传和环境相互作用的影响。表2 栽培大豆群体裂荚性状方差分析及广义遗传力性状Traits变异因素Factors自由度Df平方和Sum sq均方Mean sqF值F valueP值Pr(>P)显著性Sig遗传力Heribility裂荚率Line218160.790.73819.894<2e-16***50.7Year127.1727.168732.756<2e-16***Line:Year21836.120.1664.469<2e-16***Year:Rep10.030.0260.7060.401Residuals218981.160.037Table 2 ANOVA and Broad heritability(h2) of soybean pod dehiscencetraits of cultivated soybean3.3关联分析结果为了减少群体结构和遗传亲缘关系产生的影响，采用Q+K模型对栽培豆群体田间裂荚与1142个SNP标记进行全基因组的关联分析，找出与大豆裂荚率相关的SNP位点(表3)。利用TASSEL2.1软件对1142个SNP标记进行全基因组的扫描（P<0.01），共检测到10个SNP标记，这些标记主要位于2、3、8、9、10、14、16、18和19号染色体上，为挖掘裂荚相关基因提供了参考依据。表3 与大豆裂荚率关联的SNP位点Table 3 SNPs associated with soybean pod dehiscence 性状年份标记染色体位置F值P值裂荚率2015BARC-020045-044202478020324.8183720.00911052BARC-030669-069203471608294.728730.00992163BARC-044051-08595831747544.9309110.00818634BARC-021551-041419363825915.1250270.00683863BARC-025959-051851033705177.8040020.0057558BARC-016773-0231710385233226.8900990.0093843BARC-028723-059981421858775.5542260.0045444BARC-039625-0752316320999774.9900130.00773954BARC-041855-081101847424585.3071570.0057302BARC-017027-0217919446418417.0951430.00840025由于品种间的裂荚特性的差异，大豆裂荚率的离散程度(图1)并未显示出明显的关联关系。 图1 裂荚率的离散程度Figure 1 The rate of crack pod degree of dispersion根据田间裂荚率值全基因组关联分析结果的曼哈顿图和QQ图(图2)，在曼哈顿图中取阈值大于2的为显著关联到的SNP位点，QQ图显示出关联分析的准确性。 图2 田间裂荚率值全基因组关联分析结果的曼哈顿图和QQ图Figure 2 Manhattan and QQ plot of Genome wide association analysis for based on pod dehiscence对栽培大豆裂荚的频率分布显示裂荚率集中在0.15以下(如图3)。图3 栽培大豆裂荚的频率分布Figure 3 The frequency distribution of pod dehiscence of cultivated soybean 4 讨论通过运用分子标记的高效选择性，荚落粒性状抗性的QTL已被许多研究鉴定。Bailey等首先确定了一个主效QTL[6]，该主效QTL位点与限制性片段长度多态性标记B122-1的连锁群（LG）J（16号染色体）相连。该QTL的存在后来被证实，Funatsuki将该主效QTL精细定位[7]。在这些研究中，主效QTL紧密连锁定位到16号染色体上（原连锁群J），它们可能是相同的位点。被命名为qPDH1的主效QTL，被发现是位于SSR标记Sat_093和Sat_366之间[7]。公开的裂荚性状和初次定位的重组自交系被Muqiang Gao等用于对qPDH1进行精细定位[15]。这个重组自交系来源于抗裂性品种Young和易裂性品种PI416937。研究基于一个假设qPDH1没有强的上位性互作，极度易裂的重组自交系将保持母本PI416937的单倍型（由Sat_093和Sat_366标记划定）。如果假设成立，极度抗裂性的重组自交系将大部分保留Young的单倍型，并且这两个标记间的重组事件将有利于把qPDH1定位到更小的遗传距离内。Q+K模型广泛应用于基因组的关联分析。本研究采用Q+K模型对栽培大豆群体田间裂荚与1142个SNP标记进行全基因组的关联分析。用1142个SNP标记进行全基因组的扫描（P<0.01），共检测到10个SNP标记，这些标记主要位于2、3、8、9、10、14、16、18和19号染色体上。运用Q+K混合模型和P+K混合模型均能够较好的去除关联分析时由于群体分层引起的假阳性。通过比较分析发现，Q+K混合模型的效率最高，该模型可以更好的校正群体结构控制假阳性。大豆裂荚性状属于较为复杂的农艺性状，其表现是基因型与环境型互作的结果，同时受到很多因素的影响。遗传条件的不同可能会导致同一形状的表现存在较大差异，同样的，环境条件不同，年份不同，也会使得同一基因型的检测结果不同。温度、空气相对湿度、品种间差异、基因型等因素都会影响到大豆裂荚。本研究只是一年的数据，需要多年多点的实验验证结果的可靠性。致 谢首先，本文在导师黄方教授悉心指导不倦教诲下完成，谨向导师表示衷心的感谢。黄方教授从论文的选题、试验方案设计与落实实施、数据整理到论文写作都给予了悉心的指导。她严谨周密的治学态度、讲求实效的工作作风、渊博精深的学术造诣、对问题的敏锐洞察力、高度的责任心以及和蔼可亲的学者风度给我留下了深刻的印象，使我受益匪浅。同时，感谢一起学习的同学们，特别感谢王婷婷师姐的大力支持和热情帮助，在此谨表谢意。最后，再次感谢所有在学习和生活中帮助过我的人，谢谢！ 张 秋 雨 2016年3月于南京参考文献[1] 孙东凤, 康玉凡.大豆炸荚性研究进展[J].大豆科学, 2011, 30(6):1030-1034.[2] Cregan PB, Jarvik T, Bush AL, Shoemaker RC, Lark KG, Kahler AL, Kaya N, Van Toai TT, Lohnaes DG, Chung T, Specht JE. 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目录
摘要................................................................1
关键词..............................................................1
Abstract............................................................1
Key words...........................................................1
引言（或绪论)........................................................1
1课题背景..........................................................2
1.1本课题研究意义..................................................2
1.2国内外研究概况..................................................2
1.2.1主效QTL的鉴定................................................2
1.2.2主效QTL的重要性..............................................2
1.3关联分析........................................................3
1.3.1关联分析的应用现状............................................3
1.3.2关联分析的应用展望............................................3
2材料与方法........................................................3
2.1供试材料........................................................3
2.2试验设计及性状测定材料..........................................4
2.3性状测定........................................................4
2.4表型数据分析....................................................4
2.5关联分析........................................................4
3结果与分析........................................................4
3.1群体结构........................................................4
3.2表型数据分析....................................................4
3.3关联分析结果....................................................5
4讨论..............................................................7
致谢................................................................7
参考文献............................................................8
表1 栽培大豆群体裂荚性状的基本统计量描述性分析....................5
表2 栽培大豆群体裂荚性状的方差分析及广义遗传力....................5
表3 与大豆裂荚相关的SNP位点.... ..................................5
图1 裂荚率的离散程度 ..............................................6
图2 田间裂荚率值全基因组关联分析结果的曼哈顿图和QQ图.............6
图2 栽培大豆裂荚的频率分布........................................7
利用关联分析挖掘大豆裂荚性状的新基因
引言
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