丁香假单胞菌大豆致病变种harpin蛋白hrpzpsg引起烟草hr反应功能域的研究
Harpins是革兰氏阴性植物病原细菌产生的一类具有激发子功能的蛋白质，其编码基因为hrp基因簇成员，具有显著的诱导植物抗虫、抗病、抗旱和促进植物生长发育等多种生物学效应。本课题旨在研究丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea）Harpin蛋白hrpZPsg引起过敏性反应的功能区域。本课题组最近从丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea）A1和S1菌株中分别克隆到hrpZPsgA1和 hrpZPsgS1基因。这两个基因在核酸水平的同源性只有79%，氨基酸序列的同源性只有77%。而hrpZPsgS1在诱导HR能力显著高于hrpZPsgA1。分析表明，hrpZPsgS1与hrpZPsgA1的差异集中在3个区域，推测这三个区域可能与HR功能域相关。因此通过采用重叠PCR方法将hrpZPsgS1和hrpZPsgA1的这三个区域分别进行互换，构建了6个互换重组表达片段，通过IPTG诱导蛋白表达后，经镍柱纯化得到纯蛋白，研究重组蛋白引起过敏性反应的能力。结果显示，与hrpZPsgS1全长相比，重组蛋白S11-241-A1238-247-S1252-346 、A11-272-S1277-346 引起过敏反应的能力更好，初步预测hrpZPsgS1的242-251位氨基酸对HR没有正调控作用，hrpZPsgS1的C端负责调控过敏反应。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.2方法2
1.2.1 引物设计及片段特征 3
1.2.2 PCR扩增反应体系 3
1.2.3 纯化PCR产物 4
1.2.4使用pMD19T载体对目的片段进行TA克隆4 1.2.5连接产物的转化 4
1.2.6 质粒的提取 5
1.2.7 质粒酶切及PCR验证 5
1.2.8构建重组质粒 5
1.2.9 重组质粒的转化 6
1.2.10重组质粒的PCR筛选及验证 6
1. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.11活化表达菌株，提取粗蛋白 6
1.2.12 镍柱清洗6
1.2.13蛋白的纯化、脱盐及浓度测定6
1.2.14 SDSPAGE凝胶电泳检测 6
2结果与分析 7
2.1 hrpZPsgS1与hrpZPsgA1互换区域设计7
2.2 丁香假单胞菌大豆致病变种Harpin蛋白质编码基因hrpZPsgS1与hrpZPsgA1互换的重组片段的构建8
2.3 hrpZPsgS1与hrpZPsgA1互换的重组片段蛋白诱导表达与纯化10
2.3.1 hrpZPsgS1与hrpZPsgA1互换的重组片段蛋白诱导表达10
2.3.2 6个重组片段表达蛋白的纯化. 10
2.3.3 蛋白纯化后的脱盐及浓度测定 11
2.4 hrpZPsgS1与hrpZPsgA1互换的重组蛋白在烟草上的过敏反应11
3讨论 12
致谢 13
参考文献 13 丁香假单胞菌大豆致病变种Harpin蛋白hrpZPsg引起烟草HR反应功能域的研究
引言
革兰氏阴性植物病原细菌存在的hrp基因(hypersensitive reaction and pathogenicity gene)，决定病原菌对寄主植物的致病性和非寄主植物的HR。hrp基因赋予病原细菌在非寄主植物及抗病植物上引发过敏反应（hypersensitive response, HR）和在感病寄主植物上的致病（pathogenicity）能力。由于hrp基因成簇地存在于植物病原细菌的基因组上，所以被称为hrp基因簇[1]。20世纪80年代初Lindgren等人通过Tn5诱变丁香假单胞菌菜豆萎蔫致病变种（Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola）首次发现了hrp基因簇。此后这类基因就一直得到相关领域学者的高度重视，并进行了广泛而深入的研究。基于hrp致病岛的III泌出系统TTSS在多种病原细菌中高度保守，通过该系统，可将许多效应蛋白注入到植物细胞中[2]。Wei等[3]首次从梨火疫病菌(Erwinia amylovora)中分离出一种能引起过敏反应的蛋白激发子HrpN，随后harpin在所有常见的革兰氏阴性植物病原菌中得到了鉴定[46]。1993年何胜阳等又从Pseudomonas syringae pv.syringae 61菌株中分离到HarpinPss，由hrpZ基因编码，它也富含甘氨酸（Gly），不含半胱氨酸（Cys），热稳定，对蛋白酶K敏感。然而hrpZ和hrpN缺乏同源性，它们只有22个氨基酸存在同源性，且此片段与功能无关。这也基本符合同一植物病原细菌不同致病变种之间编码harpin的hrp基因的同源性较高，不同属的病原细菌之间编码harpin的hrp基因的同源性较低[7]。
田间实验证明Harpin可以诱导40多种作物对60多种病害及20多种虫害的抗性，并且可以使许多作物增产1045%。在离体叶片和活体棉花中，Harpin可以诱导棉花对蚜虫的抗性，促进番茄和烟草的生长[8]。克隆并利用编码Harpin 蛋白的hrp基因进行转基因育种是植物抗病基因工程研究中值得研究的一个问题。目前已获得抗病性较强的转hrp基因马铃薯、水稻和番茄等转基因作物，并且这些转基因作物还具有优良的农艺性状[9]。但其遗传稳定性及其抗病谱以及转基因植株的安全性等仍有待于进一步评价。与此同时，Harpin蛋白在寄主与非寄主植物上的诱导抗性机制是否相同也有待进一步研究。来源不同的Harpin蛋白在不同的农作物上的过敏反应程度差异很大。这些差异的进一步研究将有助于从分子水平上进一步了解病原植物的相互作用及协同进化，有助于研发新型，高效，安全的生物农药。
本课题组最近从丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea）A1和S1菌株中分别克隆到hrpZpsgA1和 hrpZpsgS1基因。这两个基因在核酸水平的同源性只有79%，氨基酸序列的同源性只有77%[10]。而在诱导HR能力的差异显著。分析表明，hrpZpsgS1与hrpZpsgA1的差异集中在3个区域，推测这三个区域可能与HR功能域相关。计划采用重叠PCR的方法将hrpZPsgS1和hrpZPsgA1的这三个区域分别进行互换，以确定其HR功能区域。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.2方法2
1.2.1 引物设计及片段特征 3
1.2.2 PCR扩增反应体系 3
1.2.3 纯化PCR产物 4
1.2.4使用pMD19T载体对目的片段进行TA克隆4 1.2.5连接产物的转化 4
1.2.6 质粒的提取 5
1.2.7 质粒酶切及PCR验证 5
1.2.8构建重组质粒 5
1.2.9 重组质粒的转化 6
1.2.10重组质粒的PCR筛选及验证 6
1. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.11活化表达菌株，提取粗蛋白 6
1.2.12 镍柱清洗6
1.2.13蛋白的纯化、脱盐及浓度测定6
1.2.14 SDSPAGE凝胶电泳检测 6
2结果与分析 7
2.1 hrpZPsgS1与hrpZPsgA1互换区域设计7
2.2 丁香假单胞菌大豆致病变种Harpin蛋白质编码基因hrpZPsgS1与hrpZPsgA1互换的重组片段的构建8
2.3 hrpZPsgS1与hrpZPsgA1互换的重组片段蛋白诱导表达与纯化10
2.3.1 hrpZPsgS1与hrpZPsgA1互换的重组片段蛋白诱导表达10
2.3.2 6个重组片段表达蛋白的纯化. 10
2.3.3 蛋白纯化后的脱盐及浓度测定 11
2.4 hrpZPsgS1与hrpZPsgA1互换的重组蛋白在烟草上的过敏反应11
3讨论 12
致谢 13
参考文献 13 丁香假单胞菌大豆致病变种Harpin蛋白hrpZPsg引起烟草HR反应功能域的研究
引言
革兰氏阴性植物病原细菌存在的hrp基因(hypersensitive reaction and pathogenicity gene)，决定病原菌对寄主植物的致病性和非寄主植物的HR。hrp基因赋予病原细菌在非寄主植物及抗病植物上引发过敏反应（hypersensitive response, HR）和在感病寄主植物上的致病（pathogenicity）能力。由于hrp基因成簇地存在于植物病原细菌的基因组上，所以被称为hrp基因簇[1]。20世纪80年代初Lindgren等人通过Tn5诱变丁香假单胞菌菜豆萎蔫致病变种（Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola）首次发现了hrp基因簇。此后这类基因就一直得到相关领域学者的高度重视，并进行了广泛而深入的研究。基于hrp致病岛的III泌出系统TTSS在多种病原细菌中高度保守，通过该系统，可将许多效应蛋白注入到植物细胞中[2]。Wei等[3]首次从梨火疫病菌(Erwinia amylovora)中分离出一种能引起过敏反应的蛋白激发子HrpN，随后harpin在所有常见的革兰氏阴性植物病原菌中得到了鉴定[46]。1993年何胜阳等又从Pseudomonas syringae pv.syringae 61菌株中分离到HarpinPss，由hrpZ基因编码，它也富含甘氨酸（Gly），不含半胱氨酸（Cys），热稳定，对蛋白酶K敏感。然而hrpZ和hrpN缺乏同源性，它们只有22个氨基酸存在同源性，且此片段与功能无关。这也基本符合同一植物病原细菌不同致病变种之间编码harpin的hrp基因的同源性较高，不同属的病原细菌之间编码harpin的hrp基因的同源性较低[7]。
田间实验证明Harpin可以诱导40多种作物对60多种病害及20多种虫害的抗性，并且可以使许多作物增产1045%。在离体叶片和活体棉花中，Harpin可以诱导棉花对蚜虫的抗性，促进番茄和烟草的生长[8]。克隆并利用编码Harpin 蛋白的hrp基因进行转基因育种是植物抗病基因工程研究中值得研究的一个问题。目前已获得抗病性较强的转hrp基因马铃薯、水稻和番茄等转基因作物，并且这些转基因作物还具有优良的农艺性状[9]。但其遗传稳定性及其抗病谱以及转基因植株的安全性等仍有待于进一步评价。与此同时，Harpin蛋白在寄主与非寄主植物上的诱导抗性机制是否相同也有待进一步研究。来源不同的Harpin蛋白在不同的农作物上的过敏反应程度差异很大。这些差异的进一步研究将有助于从分子水平上进一步了解病原植物的相互作用及协同进化，有助于研发新型，高效，安全的生物农药。
本课题组最近从丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea）A1和S1菌株中分别克隆到hrpZpsgA1和 hrpZpsgS1基因。这两个基因在核酸水平的同源性只有79%，氨基酸序列的同源性只有77%[10]。而在诱导HR能力的差异显著。分析表明，hrpZpsgS1与hrpZpsgA1的差异集中在3个区域，推测这三个区域可能与HR功能域相关。计划采用重叠PCR的方法将hrpZPsgS1和hrpZPsgA1的这三个区域分别进行互换，以确定其HR功能区域。
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