绿盲蝽乙酰胆碱酯酶基因(a216s)田间突变频率的检测
摘要:随着我国转Bt基因棉花的广泛种植，棉铃虫的发生与危害得到了有效控制，但长期以来作为次要害虫的盲蝽蟓（半翅目：盲蝽科）发生量显著增加，上升为棉田等多种作物的首要害虫。有机磷类杀虫剂的广泛使用导致许多害虫产生了明显的抗药性，盲蝽蟓对该类农药抗药性问题也日益严峻。乙酰胆碱酯酶是有机磷(OP)和氨基甲酸酯(CB)类杀虫剂的作用靶标，乙酰胆碱酯酶基因突变介导的靶标敏感性降低是许多害虫对这些杀虫剂产生抗性的重要原因。本文用药膜法测定了绿盲蝽田间种群对毒死蜱的抗性，发现其抗性水平介于0.5—13.9倍之间，并呈现黄河流域抗性高、长江下游流域抗性低的区域性特点。建立了针对绿盲蝽ace1基因A216S突变位点的Bi-pasa检测技术，并对2014年采集的6个地区绿盲蝽田间种群该位点等位基因突变频率进行了测定。结果表明滁州、南京、盐城基因突变频率较低，分别为1.67%、0和1.67%，而安阳、沧州、滨州基因突变频率较高，已分别达到43.3%、38.3%和48.3%。上述研究结果为绿盲蝽对有机磷类杀虫剂的抗性检测提供了快速筛查方法，并对深入了解绿盲蝽对机磷类杀虫剂的抗性机理及盲蝽蟓的田间防治具有重要指导意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试昆虫 2
1.2供试药剂和主要药剂 2
1.3生物测定2
1.4BiPasa检测3
1.4.1绿盲蝽cDNA模板制备3
1.4.2 PCR引物序列 3
1.4.3田间绿盲蝽种群ace1基因A216S 突变频率的检测3
2结果与分析 4
2.1绿盲蝽田间品系的生物测定结果4
2.2BiPasa检测结果5
2.3绿盲蝽田间种群ace1基因A216S 突变频率的检测5
3.讨论5
3.1绿盲蝽对毒死蜱抗性现状5
3.2 绿盲蝽AChE活性与抗药性6
3.3绿盲蝽ace1基因A216S突变与毒死蜱抗性6
致谢8
参考文献9
绿盲蝽乙酰胆碱酯酶基
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
因(A216S)田间突变频率的检测
引言
进入20世纪以来，由于转Bt基因棉花的大面积推广种植，造成棉田害虫治理方式发生一系列变化，特别是杀虫剂用量的降低，最终导致盲蝽蟓从棉田次要害虫上升成为主要害虫并波及到多种重要作物及蔬菜果树。盲蝽蟓的暴发涉及到多方面的因素，包括其本身的生物学特性、适合的温湿度和营养条件、滞后的防治措施等，而现今普遍认为最重要的原因是转Bt基因棉花的推广，由于棉铃虫等主要害虫得到了有效控制，棉田管理措施以及棉田生态系统随之发生了一系列变化，从而导致之前的次要害虫盲蝽蟓发生为害程度的上升并波及到其它作物（Hardee等，1997）。在盲蝽蟓的田间防治中，虽然使用杀虫灯、诱虫板，种植诱集带等物理防治和农业防治措施也有所应用，但目前使用最多的仍是化学防治，常用的农药主要包括：有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等。针对盲蝽蟓的杀虫剂的使用量逐年增加，不仅会损害转基因棉花的经济效益，而且杀虫剂过量的不合理的使用必将导致盲蝽蟓对杀虫剂的敏感性降低，带来抗药性问题（Qiu，2010）。
不同种类的棉盲蝽在地理分布上也有所不同，我国的重发区集中在长江流域的江苏地区以及黄河流域的河北、河南和山东等地，种类以绿盲蝽和中黑盲蝽为主。本实验室研究发现山东滨州地区绿盲蝽种群已对毒死蜱产生了中等程度的抗药性,并发现了乙酰胆碱酯酶基因的突变。乙酰胆碱酯酶是有机磷(OP)和氨基甲酸酯(CB)类杀虫剂的作用靶标，乙酰胆碱酯酶基因发生突变，对有机磷和氨基甲酸醋酯类杀虫剂敏感性降低，是许多害虫对这些杀虫剂产生抗性的一个重要原因。乙酰胆碱酯酶（AChE）作为一种水解酶在生物神经传导中的起着重要的作用，它的主要功能是将神经递质乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸，从而控制乙酰胆碱在神经突触中的水平，并中止正常的神经冲动的传递，保证神经信号分子正常的传导（王敦等，2006）。AChE是有机磷（OP）和氨基甲酸酯（CB）类杀虫剂的作用靶标，OP和CB抑制乙酰胆碱酯酶活性的机制主要是：乙酰胆碱酯酶有两个活性部位，即催化部位和结合部位。
近些年随着各地盲蝽蟓为害程度的不断加重，我国这方面的研究还处在起步阶段，过度的化学农药防治使得盲蝽蟓对杀虫剂的抗药性开始产生。研究报道国内部分地区的绿盲蝽对硫丹、三氟氯氰菊酯和马拉硫磷已经产生了低水平抗性（谭瑶，张帅，高希武，2012）。但是国内对盲蝽蟓的报道多见为抗性监测，而对盲蝽蟓抗性机理的研究还报道还很少。因此，本实验选择以绿盲蝽为研究对象，对绿盲蝽田间种群ace1基因A216S的突变频率进行检测，为更好地开展绿盲蝽的抗性治理提供科学依据，为更深入的研究包括乙酰胆碱酯酶在绿盲蝽对毒死蜱抗性中的作用对于绿盲蝽的防治、新型杀虫剂的研制以及农业生产具有重要的理论指导意义。
1 材料与方法
1.1供试昆虫
绿盲蝽室内敏感品系（SLF）：中国农业科学院植物保护研究所河北廊坊基地提供，在室内人工饲养45代以上，期间未接触任何杀虫剂。六个田间绿盲蝽种群分别采集于滁州、沧州、滨州、安阳、盐城、南京六个地区。
饲养条件：温度为26±1°C，相对湿度为70％左右，光周期为15L∶9D。成虫的主要饲料为四季豆，成虫期饲喂5%的蜂蜜水补充营养，供产卵用的四季豆需人为制造一些伤口，卵直接产于四季豆上后收集孵化，若虫的主要饲料为新鲜玉米。
1.2 主要药剂和仪器
药剂:40%毒死蜱乳油（湖北仙隆化工股份有限公司）、 Tkara公司产品：反转录所用试剂、WizardPCRPrPesDNA纯化试剂盒、DNTp Mixture、rTaq、LA Taq、Ribonuclease Inhibitor；Invitrogen公司产品：TRIzol、Random Primer、Topo XL PCR Cloning kit；Promega公司产品：PeasyT3 cloning vector；PCR引物合成及产物测序均有上海Incitrogen公司完成。
仪器：PCR扩增仪Mastercycler? epgradient S型PCR仪，eppendorf公司；恒温振荡器ZHWY200B，上海智成分析制造有限公司；超纯水器E1IX10，美国millipore公司；Eppendorf 5415R型冷冻离心机，德国eppendorf公司；Spectra max?340PC型酶标仪，美国Applied Biosystems公司；Micro one微型离心机，TOMY公司；烘箱MC000712，美国MMM公司；制冰机SIMF124，日本SANYO公司；超低温冰箱906，美国FORMA公司；生物安全柜，宁波江南仪器厂；凝胶成像系统Gel Doc2000，Bio Rad公司；Nanodrop100光光度计，Thermo公司；
1.3生物测定
采用药膜法对每一代进行生物测定，确定其LC50值。（药膜法：将药剂用丙酮稀释5~7个浓度梯度，每个浓度的药剂吸取200μl滴入20ml的闪烁瓶中快速滚动，使得瓶壁沾满药剂，用丙酮作为空白对照。待瓶内丙酮挥发殆尽，药剂自然晾干后，每个瓶内接入5头试虫（羽化10~15天成虫），并加入一片约3mm厚的四季豆作为补充饲料，每个重复4~5个瓶子，每个浓度5个重复。接入试虫之后，用纱布和橡皮筋封住瓶口。48h后查结果，用小号毛笔轻触试虫的身体，不能正常前行则视为死亡。）
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试昆虫 2
1.2供试药剂和主要药剂 2
1.3生物测定2
1.4BiPasa检测3
1.4.1绿盲蝽cDNA模板制备3
1.4.2 PCR引物序列 3
1.4.3田间绿盲蝽种群ace1基因A216S 突变频率的检测3
2结果与分析 4
2.1绿盲蝽田间品系的生物测定结果4
2.2BiPasa检测结果5
2.3绿盲蝽田间种群ace1基因A216S 突变频率的检测5
3.讨论5
3.1绿盲蝽对毒死蜱抗性现状5
3.2 绿盲蝽AChE活性与抗药性6
3.3绿盲蝽ace1基因A216S突变与毒死蜱抗性6
致谢8
参考文献9
绿盲蝽乙酰胆碱酯酶基
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
因(A216S)田间突变频率的检测
引言
进入20世纪以来，由于转Bt基因棉花的大面积推广种植，造成棉田害虫治理方式发生一系列变化，特别是杀虫剂用量的降低，最终导致盲蝽蟓从棉田次要害虫上升成为主要害虫并波及到多种重要作物及蔬菜果树。盲蝽蟓的暴发涉及到多方面的因素，包括其本身的生物学特性、适合的温湿度和营养条件、滞后的防治措施等，而现今普遍认为最重要的原因是转Bt基因棉花的推广，由于棉铃虫等主要害虫得到了有效控制，棉田管理措施以及棉田生态系统随之发生了一系列变化，从而导致之前的次要害虫盲蝽蟓发生为害程度的上升并波及到其它作物（Hardee等，1997）。在盲蝽蟓的田间防治中，虽然使用杀虫灯、诱虫板，种植诱集带等物理防治和农业防治措施也有所应用，但目前使用最多的仍是化学防治，常用的农药主要包括：有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等。针对盲蝽蟓的杀虫剂的使用量逐年增加，不仅会损害转基因棉花的经济效益，而且杀虫剂过量的不合理的使用必将导致盲蝽蟓对杀虫剂的敏感性降低，带来抗药性问题（Qiu，2010）。
不同种类的棉盲蝽在地理分布上也有所不同，我国的重发区集中在长江流域的江苏地区以及黄河流域的河北、河南和山东等地，种类以绿盲蝽和中黑盲蝽为主。本实验室研究发现山东滨州地区绿盲蝽种群已对毒死蜱产生了中等程度的抗药性,并发现了乙酰胆碱酯酶基因的突变。乙酰胆碱酯酶是有机磷(OP)和氨基甲酸酯(CB)类杀虫剂的作用靶标，乙酰胆碱酯酶基因发生突变，对有机磷和氨基甲酸醋酯类杀虫剂敏感性降低，是许多害虫对这些杀虫剂产生抗性的一个重要原因。乙酰胆碱酯酶（AChE）作为一种水解酶在生物神经传导中的起着重要的作用，它的主要功能是将神经递质乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸，从而控制乙酰胆碱在神经突触中的水平，并中止正常的神经冲动的传递，保证神经信号分子正常的传导（王敦等，2006）。AChE是有机磷（OP）和氨基甲酸酯（CB）类杀虫剂的作用靶标，OP和CB抑制乙酰胆碱酯酶活性的机制主要是：乙酰胆碱酯酶有两个活性部位，即催化部位和结合部位。
近些年随着各地盲蝽蟓为害程度的不断加重，我国这方面的研究还处在起步阶段，过度的化学农药防治使得盲蝽蟓对杀虫剂的抗药性开始产生。研究报道国内部分地区的绿盲蝽对硫丹、三氟氯氰菊酯和马拉硫磷已经产生了低水平抗性（谭瑶，张帅，高希武，2012）。但是国内对盲蝽蟓的报道多见为抗性监测，而对盲蝽蟓抗性机理的研究还报道还很少。因此，本实验选择以绿盲蝽为研究对象，对绿盲蝽田间种群ace1基因A216S的突变频率进行检测，为更好地开展绿盲蝽的抗性治理提供科学依据，为更深入的研究包括乙酰胆碱酯酶在绿盲蝽对毒死蜱抗性中的作用对于绿盲蝽的防治、新型杀虫剂的研制以及农业生产具有重要的理论指导意义。
1 材料与方法
1.1供试昆虫
绿盲蝽室内敏感品系（SLF）：中国农业科学院植物保护研究所河北廊坊基地提供，在室内人工饲养45代以上，期间未接触任何杀虫剂。六个田间绿盲蝽种群分别采集于滁州、沧州、滨州、安阳、盐城、南京六个地区。
饲养条件：温度为26±1°C，相对湿度为70％左右，光周期为15L∶9D。成虫的主要饲料为四季豆，成虫期饲喂5%的蜂蜜水补充营养，供产卵用的四季豆需人为制造一些伤口，卵直接产于四季豆上后收集孵化，若虫的主要饲料为新鲜玉米。
1.2 主要药剂和仪器
药剂:40%毒死蜱乳油（湖北仙隆化工股份有限公司）、 Tkara公司产品：反转录所用试剂、WizardPCRPrPesDNA纯化试剂盒、DNTp Mixture、rTaq、LA Taq、Ribonuclease Inhibitor；Invitrogen公司产品：TRIzol、Random Primer、Topo XL PCR Cloning kit；Promega公司产品：PeasyT3 cloning vector；PCR引物合成及产物测序均有上海Incitrogen公司完成。
仪器：PCR扩增仪Mastercycler? epgradient S型PCR仪，eppendorf公司；恒温振荡器ZHWY200B，上海智成分析制造有限公司；超纯水器E1IX10，美国millipore公司；Eppendorf 5415R型冷冻离心机，德国eppendorf公司；Spectra max?340PC型酶标仪，美国Applied Biosystems公司；Micro one微型离心机，TOMY公司；烘箱MC000712，美国MMM公司；制冰机SIMF124，日本SANYO公司；超低温冰箱906，美国FORMA公司；生物安全柜，宁波江南仪器厂；凝胶成像系统Gel Doc2000，Bio Rad公司；Nanodrop100光光度计，Thermo公司；
1.3生物测定
采用药膜法对每一代进行生物测定，确定其LC50值。（药膜法：将药剂用丙酮稀释5~7个浓度梯度，每个浓度的药剂吸取200μl滴入20ml的闪烁瓶中快速滚动，使得瓶壁沾满药剂，用丙酮作为空白对照。待瓶内丙酮挥发殆尽，药剂自然晾干后，每个瓶内接入5头试虫（羽化10~15天成虫），并加入一片约3mm厚的四季豆作为补充饲料，每个重复4~5个瓶子，每个浓度5个重复。接入试虫之后，用纱布和橡皮筋封住瓶口。48h后查结果，用小号毛笔轻触试虫的身体，不能正常前行则视为死亡。）
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