抗多菌灵核盘菌高通量分子检测技术的建立及其在抗性监测中的应用
油菜菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的一种分布较广、破坏性较强的世界性病害，该病不仅减少了油菜产量，而且降低了油菜品质，给世界油菜生产造成严重的经济损失。一直以来，油菜菌核病主要是以多菌灵为主流药剂的化学防治为主。但是随着多菌灵的长期大量使用，田间抗性群体分布范围逐年扩大，抗性群体比例逐年上升，最终导致该病防效下降。传统的抗药性检测方法主要采用菌丝生长抑制浓度法，但该方法存在检测周期长、操作繁琐、检测效率低等诸多缺点。本文基于环介导恒温扩增技术（LAMP），以核盘菌对多菌灵抗药性基因型E198A的β微管蛋白基因为靶标，经过人工错配，设计并筛选LAMP特异引物，对检测体系各组分浓度配比进行优化，建立了一种核盘菌对多菌灵抗性的快速、高通量的分子检测技术，该检测技术能特异性鉴定核盘菌对多菌灵的抗药性菌株；通过人工接种对比试验及田间抗性检测试验，进一步证实该检测技术可靠、稳定、可操作性强，在生产中具有广阔的应用前景。可用于核盘菌对多菌灵抗药性群体发展的动态监测、抗性风险评估及流行预警，为油菜菌核病的抗性治理提供用药指导。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
1 材料与方法 2
1.1 供试材料及试剂 2
1.2 引物设计 3
1.3 基因组DNA的快速提取 3
1.4 LAMP反应体系的优化与建立 3
1.4.1 Bst DNA聚合酶的优化 4
1.4.2 dNTP的优化 4
1.4.3 甜菜碱的优化 4
1.4.4 LAMP引物的优化 4
1.4.5 Mg2+的优化 4
1.4.6 羟基萘酚蓝（HNB）的优化 4
1.4.7 LF/LB的优化 4
1.5 LAMP引物的特异性 4
1.6 LAMP反应条件的优化 4
1.7 LAMP产物的酶切及序列分析 4
1.8 LAMP反应的特异性 5
1.9 LAMP与PCR的灵敏度 5
1.10 LAMP反 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
应的重复性 5
1.11 LAMP，PCR和MIC的比较 5
1.12 LAMP在大田油菜菌核病菌抗药性监测中的应用 5
2 结果与分析 5
2.1 LAMP引物特异性扩增 5
2.2 LAMP反应体系的优化 6
2.3 LAMP反应条件的优化 6
2.4 LAMP产物的验证 7
2.5 LAMP的特异性 8
2.6 LAMP和PCR的灵敏度 8
2.7 LAMP的重复性 9
2.8 LAMP，PCR和MIC的比较 9
2.9 LAMP在田间菌核病菌抗药性监测中的应用 10
3 讨论 10
致谢 12
参考文献： 13
抗多菌灵核盘菌高通量分子检测技术的建立
及其在抗性监测中的应用
引言
由核盘菌（Sclerotiniasclertiorum）引起的油菜菌核病是油菜生产中的重大病害之一[1]，常造成菜籽减产和含油量降低[2]，一般损失率8.51%～30.70%，发病严重时绝收[3]。该病菌寄主范围十分广泛，能侵染75科400余种植物[45]。一直以来，以多菌灵为主的苯并咪唑类药剂被用于油菜菌核病的化学防控。但近年来，随着使用年限的增长及使用剂量的增加，油菜菌核病菌已对多菌灵产生抗性，且抗性群体分布逐年扩大，抗性群体比例逐年上升[69]。
大学杀菌剂生物学实验室发现核盘菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由β微管蛋白基因（SS1G_04652.3）第198或200位氨基酸密码子突变造成，第198位氨基酸密码子GAG（Glu）→GCG（Ala）的突变对多菌灵表现为高抗，第200位氨基酸密码子TTC（Phe）→TAC（Tyr）的突变对多菌灵表现为低抗。其中第198位突变类型占所有抗药性突变类型总量的90%以上，成为病原菌产生田间抗药性的主要原因。
植物病原菌的抗药性检测能为植物病害抗药性流行预警、抗药性治理提供重要的参考依据。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性。但该方法存在检测周期长、操作繁琐、检测效率低等诸多缺点。本文在抗药性机制研究的基础上，基于环介导恒温扩增技术建立了一种检测核盘菌对多菌灵的抗性的快速、准确、高通量分子技术。
环介导恒温扩增反应（loopmediated isothermal amplification，LAMP）是一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，已经应用于检测病原菌等诸多领域[1011]。该技术原理是：利用一套（4种）特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，6065℃范围60 min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝（HNB）是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性（没有扩增出产物）时为紫色，阳性（有产物扩增）时为天蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原的快速诊断及检测[1215]。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。该检测方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对油菜菌核病的抗性治理、抗药性流行预警具有重要的现实意义。
1 材料与方法
1.1 供试菌株及试剂
核盘菌HA61为野生型菌株，对多菌灵敏感；核盘菌TZ25为田间采集到的多菌灵高水平抗性菌株，在β微管蛋白的198位存在点突变（GAG → GCG，E198A）。其他供试菌株见表1。
表1：供试菌株
Fungal species
Isolates
Genotype description
Origin
Resistance phenotypea
LAMPb
S. sclerotiorum
HA61
Wild type
Jiangsu province, China
MBCS
－
S. sclerotiorum
TZ25
Mutation at codon 198 of βtubulin (E198A)
Jiangsu province, China
MBCHR
＋
S. sclerotiorum
JY4016
Mutation at codon 200 of βtubulin (F200Y)
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
1 材料与方法 2
1.1 供试材料及试剂 2
1.2 引物设计 3
1.3 基因组DNA的快速提取 3
1.4 LAMP反应体系的优化与建立 3
1.4.1 Bst DNA聚合酶的优化 4
1.4.2 dNTP的优化 4
1.4.3 甜菜碱的优化 4
1.4.4 LAMP引物的优化 4
1.4.5 Mg2+的优化 4
1.4.6 羟基萘酚蓝（HNB）的优化 4
1.4.7 LF/LB的优化 4
1.5 LAMP引物的特异性 4
1.6 LAMP反应条件的优化 4
1.7 LAMP产物的酶切及序列分析 4
1.8 LAMP反应的特异性 5
1.9 LAMP与PCR的灵敏度 5
1.10 LAMP反 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
应的重复性 5
1.11 LAMP，PCR和MIC的比较 5
1.12 LAMP在大田油菜菌核病菌抗药性监测中的应用 5
2 结果与分析 5
2.1 LAMP引物特异性扩增 5
2.2 LAMP反应体系的优化 6
2.3 LAMP反应条件的优化 6
2.4 LAMP产物的验证 7
2.5 LAMP的特异性 8
2.6 LAMP和PCR的灵敏度 8
2.7 LAMP的重复性 9
2.8 LAMP，PCR和MIC的比较 9
2.9 LAMP在田间菌核病菌抗药性监测中的应用 10
3 讨论 10
致谢 12
参考文献： 13
抗多菌灵核盘菌高通量分子检测技术的建立
及其在抗性监测中的应用
引言
由核盘菌（Sclerotiniasclertiorum）引起的油菜菌核病是油菜生产中的重大病害之一[1]，常造成菜籽减产和含油量降低[2]，一般损失率8.51%～30.70%，发病严重时绝收[3]。该病菌寄主范围十分广泛，能侵染75科400余种植物[45]。一直以来，以多菌灵为主的苯并咪唑类药剂被用于油菜菌核病的化学防控。但近年来，随着使用年限的增长及使用剂量的增加，油菜菌核病菌已对多菌灵产生抗性，且抗性群体分布逐年扩大，抗性群体比例逐年上升[69]。
大学杀菌剂生物学实验室发现核盘菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由β微管蛋白基因（SS1G_04652.3）第198或200位氨基酸密码子突变造成，第198位氨基酸密码子GAG（Glu）→GCG（Ala）的突变对多菌灵表现为高抗，第200位氨基酸密码子TTC（Phe）→TAC（Tyr）的突变对多菌灵表现为低抗。其中第198位突变类型占所有抗药性突变类型总量的90%以上，成为病原菌产生田间抗药性的主要原因。
植物病原菌的抗药性检测能为植物病害抗药性流行预警、抗药性治理提供重要的参考依据。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性。但该方法存在检测周期长、操作繁琐、检测效率低等诸多缺点。本文在抗药性机制研究的基础上，基于环介导恒温扩增技术建立了一种检测核盘菌对多菌灵的抗性的快速、准确、高通量分子技术。
环介导恒温扩增反应（loopmediated isothermal amplification，LAMP）是一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，已经应用于检测病原菌等诸多领域[1011]。该技术原理是：利用一套（4种）特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，6065℃范围60 min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝（HNB）是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性（没有扩增出产物）时为紫色，阳性（有产物扩增）时为天蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原的快速诊断及检测[1215]。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。该检测方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对油菜菌核病的抗性治理、抗药性流行预警具有重要的现实意义。
1 材料与方法
1.1 供试菌株及试剂
核盘菌HA61为野生型菌株，对多菌灵敏感；核盘菌TZ25为田间采集到的多菌灵高水平抗性菌株，在β微管蛋白的198位存在点突变（GAG → GCG，E198A）。其他供试菌株见表1。
表1：供试菌株
Fungal species
Isolates
Genotype description
Origin
Resistance phenotypea
LAMPb
S. sclerotiorum
HA61
Wild type
Jiangsu province, China
MBCS
－
S. sclerotiorum
TZ25
Mutation at codon 198 of βtubulin (E198A)
Jiangsu province, China
MBCHR
＋
S. sclerotiorum
JY4016
Mutation at codon 200 of βtubulin (F200Y)
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