二化螟γ氨基丁酸受体亚基的克隆
二化螟是重要的农业害虫，它每年造成的危害都会造成巨大的经济损失，严重威胁农业生产和粮食安全。γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)是动物体内重要的抑制性神经递质，抑制动作电位的产生，破坏GABA受体的作用位点，即能造成动物神经功能失常。近年来GABA受体基因及其表达的研究已为很多杀虫剂药物的研发提供了实验依据，并基于此开发的杀虫剂已取得较好防效。本研究以多种其他多种生物的GABA受体序列设计简并引物为基础，获得不同于已公布二化螟转录组数据库中的GABA受体亚基基因片段，进一步明确完善了二化螟GABA受体亚基的序列，为深入研究二化螟GABA受体功能提供更加完整的数据基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1. 材料与方法 3
1.1 供试昆虫 3
1.2主要试剂 3
1.3主要仪器 3
2. 实验方法 4
2.1 总RNA的提取 4
2.2 cDNA的合成 4
2.3 GABA 兼并引物PCR 4
2.3.1 引物序列 4
2.3.2 反应体系 5
2.3.3 PCR程序 (50 μl LATaq) 5
2.3.4 电泳检测 5
2.4 GABA 5’RACEPCR 5
2.4.1 引物序列 5
2.4.2反应体系 6
2.4.3 PCR程序 (25 μl rTaq) 6
2.4.4电泳检测 6
2.5 GABA3’RACEPCR 6
2.5.1引物序列 6
2.5.2 反应体系 7
2.5.3 PCR程序(25μl primeSTAR Max) 7
2.5.4 电泳检测 7
2.6 GABAEndtoend PCR 7
2.6.1引物序列 7
2.6.2反应体系 8
2.6.3 PCR程序(25μlprimeSTAR Max) 8
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/> 2.6.4 电泳检测 8
2.7 PCR产物的回收纯化、克隆及测序测定 8
2.7.1 PCR产物的回收纯化 8
2.7.2 PCR回收产物的连接 8
2.7.3 PCR回收产物的转化 9
2.7.4阳性克隆检测 9
3. 结果与分析 9
3.1 GABA受体的克隆 9
3.1. 1 GABA 兼并引物PCR紫外凝胶成像电泳结果 9
3.1.2 GABA5’RACEPCR紫外凝胶成像电泳结果 10
3.1.3 GABA3’RACEPCR紫外凝胶成像电泳结果 10
3.1.4 GABAEndtoend PCR紫外凝胶成像电泳结果 11
3.2 GABA受体基因克隆结果分析 11
4.讨论 12
致 谢 12
参考文献 13
二化螟γ氨基丁酸（GABA）受体亚基的克隆
引言
引言
二化螟（Chilo suppressalis（Walker））是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，对水稻生产造成巨大损失，严重威胁我国粮食安全。γ氨基丁酸（GABA）是脊椎动物和无脊椎动物体内一种主要的抑制性神经递质，是一种来源于非蛋白质的重要氨基酸，它的合成受谷氨酸脱羧酶控制，通过与GABA受体结合而发挥其生物学功能[1,2]。其作用与乙酰胆碱刚好相反，乙酰胆碱是引起兴奋，造成突触后膜的去极化作用，从而产生一个动作电位，而GABA是引起神经传递的抑制，造成突触后膜的超极化作用，减少离子内流、降低细胞代谢及氧消耗等机制，使突触后神经元处于保护性抑制状态[3]。GABA受体作为杀
虫剂重要靶标之一，已日渐成为杀虫剂毒理机制研究的焦点[4]，尤其是分子生物学技术的迅速发展及其在昆虫毒理学中的运用，使得从分子水平上认识GABA受体结构与性质、揭示杀虫剂的毒理机制及害虫抗药性机制成为可能。
二化螟（Chilo suppressalis（Walker））属鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)禾草螟属(ChiloZinchin)，是我国水稻上常发的蛀茎类害虫。自20世纪70年代中期后，该种群上升为稻螟中的优势种群，素有“南螟北蝗”之说，对水稻、茭白和甘蔗等禾本类经济作物危害日渐严重[5]。特别是近年来，由于我国水稻种植结构和水稻种植品种的改变，双季稻面积缩小，单季稻面积扩大，形成单、双季稻，早、中、迟熟品种混栽的局面，以及随着水稻种子市场的放开，大田种植品种增多，利于二化螟发生的杂交稻、籼稻占优势等因素，给二化螟提供了多层次的营养条件，使其随时都有适宜的寄主植物，以致经常性暴发危害。
GABA(γ－aminobutyric acid）是一种天然的非蛋白质氨基酸，作为一种主要的抑制性神经递质，由谷氨酸脱羧酶控制其合成，存在于非脊椎动物的周缘系统和脊椎动物的中枢神经系统中。其抑制作用是通过GABA受体介导。在生物体内，它是由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下脱羧形成的。昆虫体内的γ一氨基丁酸主要存在于中枢神经系统和神经肌肉连接点处，在昆虫的GABA能系统(GABA ergic systerm)中。GABA通过与GABA受体结合而发挥其生物学功能。其作用与乙酰胆碱刚好相反，乙酰胆碱是引起兴奋，造成突触后膜的去极化作用，而GABA是引起神经传递的抑制，造成突触后膜的超极化作用，减少离子内流、降低细胞代谢及氧消耗等机制，使突触后神经元处于保护性抑制状态。
GABA受体是指突触后膜上能识别并结合GABA的部位,当它与GABA结合后，可导致细胞膜离子通透性变化[6]。GABA与不同受体结合，会产生不同的调节性影响。GABA受体主要有3种，它们是：对荷包牡丹碱敏感的GABAA受体，该受体分布于突触前、后膜和树突上，与氯离子通道有关，在这一受体上激活氯离子通道的开放，造成超极化，因而起抑制作用，并受苯并二氮杂卓和巴比妥盐的调剂；对氯苯氨丁酸敏感的GABAB受体，主要分布于突触前膜上，它通过G蛋白控制Ca2+和K+通道，受氯苯氨丁酸和2羟基氯苯氨丁酸抑制；以及在哺乳动物视网膜的平行双极神经元上发现的GABAC受体，它对荷包牡丹碱和氯苯氨丁酸不敏感，能被GABA类似物，顺4氨基巴豆酸（CACA）和反4氨基巴豆酸（TACA）激活，GABAc与氯离子通道有关，但并不受苯并二氮杂卓或巴比妥盐的调剂[7~9]。一般认为昆虫的GABA受体与脊椎动物的GABAA非常相似，因为它与氯离子通道有关，并受苯并二氮杂卓和巴比妥盐的调节。但它似乎对荷包牡丹碱不敏感，许多研究结果表明两者在药理学和生物学等方面还是存在差异[10,11]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1. 材料与方法 3
1.1 供试昆虫 3
1.2主要试剂 3
1.3主要仪器 3
2. 实验方法 4
2.1 总RNA的提取 4
2.2 cDNA的合成 4
2.3 GABA 兼并引物PCR 4
2.3.1 引物序列 4
2.3.2 反应体系 5
2.3.3 PCR程序 (50 μl LATaq) 5
2.3.4 电泳检测 5
2.4 GABA 5’RACEPCR 5
2.4.1 引物序列 5
2.4.2反应体系 6
2.4.3 PCR程序 (25 μl rTaq) 6
2.4.4电泳检测 6
2.5 GABA3’RACEPCR 6
2.5.1引物序列 6
2.5.2 反应体系 7
2.5.3 PCR程序(25μl primeSTAR Max) 7
2.5.4 电泳检测 7
2.6 GABAEndtoend PCR 7
2.6.1引物序列 7
2.6.2反应体系 8
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2.7 PCR产物的回收纯化、克隆及测序测定 8
2.7.1 PCR产物的回收纯化 8
2.7.2 PCR回收产物的连接 8
2.7.3 PCR回收产物的转化 9
2.7.4阳性克隆检测 9
3. 结果与分析 9
3.1 GABA受体的克隆 9
3.1. 1 GABA 兼并引物PCR紫外凝胶成像电泳结果 9
3.1.2 GABA5’RACEPCR紫外凝胶成像电泳结果 10
3.1.3 GABA3’RACEPCR紫外凝胶成像电泳结果 10
3.1.4 GABAEndtoend PCR紫外凝胶成像电泳结果 11
3.2 GABA受体基因克隆结果分析 11
4.讨论 12
致 谢 12
参考文献 13
二化螟γ氨基丁酸（GABA）受体亚基的克隆
引言
引言
二化螟（Chilo suppressalis（Walker））是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，对水稻生产造成巨大损失，严重威胁我国粮食安全。γ氨基丁酸（GABA）是脊椎动物和无脊椎动物体内一种主要的抑制性神经递质，是一种来源于非蛋白质的重要氨基酸，它的合成受谷氨酸脱羧酶控制，通过与GABA受体结合而发挥其生物学功能[1,2]。其作用与乙酰胆碱刚好相反，乙酰胆碱是引起兴奋，造成突触后膜的去极化作用，从而产生一个动作电位，而GABA是引起神经传递的抑制，造成突触后膜的超极化作用，减少离子内流、降低细胞代谢及氧消耗等机制，使突触后神经元处于保护性抑制状态[3]。GABA受体作为杀
虫剂重要靶标之一，已日渐成为杀虫剂毒理机制研究的焦点[4]，尤其是分子生物学技术的迅速发展及其在昆虫毒理学中的运用，使得从分子水平上认识GABA受体结构与性质、揭示杀虫剂的毒理机制及害虫抗药性机制成为可能。
二化螟（Chilo suppressalis（Walker））属鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)禾草螟属(ChiloZinchin)，是我国水稻上常发的蛀茎类害虫。自20世纪70年代中期后，该种群上升为稻螟中的优势种群，素有“南螟北蝗”之说，对水稻、茭白和甘蔗等禾本类经济作物危害日渐严重[5]。特别是近年来，由于我国水稻种植结构和水稻种植品种的改变，双季稻面积缩小，单季稻面积扩大，形成单、双季稻，早、中、迟熟品种混栽的局面，以及随着水稻种子市场的放开，大田种植品种增多，利于二化螟发生的杂交稻、籼稻占优势等因素，给二化螟提供了多层次的营养条件，使其随时都有适宜的寄主植物，以致经常性暴发危害。
GABA(γ－aminobutyric acid）是一种天然的非蛋白质氨基酸，作为一种主要的抑制性神经递质，由谷氨酸脱羧酶控制其合成，存在于非脊椎动物的周缘系统和脊椎动物的中枢神经系统中。其抑制作用是通过GABA受体介导。在生物体内，它是由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下脱羧形成的。昆虫体内的γ一氨基丁酸主要存在于中枢神经系统和神经肌肉连接点处，在昆虫的GABA能系统(GABA ergic systerm)中。GABA通过与GABA受体结合而发挥其生物学功能。其作用与乙酰胆碱刚好相反，乙酰胆碱是引起兴奋，造成突触后膜的去极化作用，而GABA是引起神经传递的抑制，造成突触后膜的超极化作用，减少离子内流、降低细胞代谢及氧消耗等机制，使突触后神经元处于保护性抑制状态。
GABA受体是指突触后膜上能识别并结合GABA的部位,当它与GABA结合后，可导致细胞膜离子通透性变化[6]。GABA与不同受体结合，会产生不同的调节性影响。GABA受体主要有3种，它们是：对荷包牡丹碱敏感的GABAA受体，该受体分布于突触前、后膜和树突上，与氯离子通道有关，在这一受体上激活氯离子通道的开放，造成超极化，因而起抑制作用，并受苯并二氮杂卓和巴比妥盐的调剂；对氯苯氨丁酸敏感的GABAB受体，主要分布于突触前膜上，它通过G蛋白控制Ca2+和K+通道，受氯苯氨丁酸和2羟基氯苯氨丁酸抑制；以及在哺乳动物视网膜的平行双极神经元上发现的GABAC受体，它对荷包牡丹碱和氯苯氨丁酸不敏感，能被GABA类似物，顺4氨基巴豆酸（CACA）和反4氨基巴豆酸（TACA）激活，GABAc与氯离子通道有关，但并不受苯并二氮杂卓或巴比妥盐的调剂[7~9]。一般认为昆虫的GABA受体与脊椎动物的GABAA非常相似，因为它与氯离子通道有关，并受苯并二氮杂卓和巴比妥盐的调节。但它似乎对荷包牡丹碱不敏感，许多研究结果表明两者在药理学和生物学等方面还是存在差异[10,11]。
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