细胞骨架作用药物对离体培养棉花胚珠纤维发育的影响
棉花纤维是由胚珠表皮细胞发育而来的单细胞纤维，细胞骨架与棉花纤维细胞起始和伸长发育相关。但是微丝、微管结构的变化对于棉花纤维伸生长发育调控作用及其机制尚未完全阐明。选用3种微丝作用药物（Jasplakinolide、红海海绵素B、细胞松弛素D）和2种微管作用药物（紫杉醇和氨磺乐灵）处理陆地棉遗传标准系（Texas Marker-1，TM-1）离体培养胚珠，观察微丝结构的变化及其对棉花胚珠和纤维发育的影响。结果表明棉花胚珠对不同药物的敏感浓度不一样。2 μmol·L-1 Jasplakinolide处理使胚珠鲜重明显下降，并且使胚珠纤维纤维量、纤维长度减少，并且可以导致微丝骨架的聚合；红海海绵素B处理后，胚珠鲜重明显下降，但各浓度间并无显著差异， 200 nmol·L-1处理的胚珠纤维几乎不长，并且可以使微丝骨架一端聚合，一端解聚；5 μmol·L-1 细胞松弛素D对棉花胚珠生长的抑制作用最明显，能够使微丝骨架捆绑成束。这些现象表明微丝作用药物可以改变微丝的结构，从而影响棉花胚珠及纤维的生长。4 μmol·L-1 紫杉醇处理的胚珠鲜重明显下降，生长畸形，纤维量减少；用氨磺乐灵处理使棉花胚珠纤维鲜重明显下降，不长纤维，但是不同浓度处理间无显著差异。微管作用药物可以抑制胚珠及纤维的生长。本研究为进一步研究微丝、微管对纤维发育的调控机制奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1植物材料3
1.1.2主要试剂3
1.1.3培养基配方3
1.2方法 4
1.2.1胚珠离体培养4
1.2.2胚珠和纤维发育的观察4
1.2.3微丝骨架结构的观察4
2结果与分析4
2.1微丝作用药物对棉花离体培养胚珠纤发育的影响4
2.1.1 Jasplakinolide对棉花离体培养胚珠纤维发育的影响4
2.1.2红海海绵素B对棉花离体培养胚珠纤维发育的影响6
2.1.3 细胞松弛素 D对棉花离体培养胚珠纤维发育的影响8
2.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
2微管作用药物对棉花离体培养胚珠纤发育的影响11
2.2.1紫杉醇对棉花离体培养胚珠纤维发育的影响10
2.2.2 氨磺乐灵对棉花离体培养胚珠纤维发育的影响11
3讨论 13
致谢13
参考文献14
细胞骨架作用药物对离体培养棉花胚珠纤维发育的影响
引言
棉花纤维是最重要的天然纤维，是纺织工业的原料，广泛应用于医疗、汽车、电子行业。棉纤维细胞是由胚珠外珠被表皮细胞分化而成的，单细胞纤维，是高等植物中伸长最快、合成纤维素最多的模式单细胞［１］。根据细胞结构、功能、基因表达变化特征的不同，棉花纤维发育可划分为分化、伸长、次生壁加厚以及细胞成熟四个既相互不同又有部分重叠的发育阶段［２］。
细胞骨架（cytoskeleton, CSK）是位于细胞膜内侧面的蛋白质丝纤维网架系统。细胞架由微管（microtubule）、微丝（microfilament）和中间纤维（intermediate filament）共同构成。微管主要由α、β微管蛋白（tubulin)和少量的微管结合蛋白（microtubule associated protein, MAP）构成，它们具有集结成是25nm左右的管状纤维的功能［３］。微丝是由肌动蛋白（actin）的亚单位组成的螺旋状结构,有极性。肌动蛋白以两种形态存在,聚合态纤维肌动蛋白（Factin）及可溶性球状肌动蛋白（Gactin），两种形态的肌动蛋白之间存在着动态平衡，但只有聚合态肌动蛋白才具有生物学作用［４］。
植物细胞的形态建成是细胞壁形成及细胞生长分化的结果, 这一过程需要由微管和微丝骨架共同调节，且微管和微丝的这种协调作用是通过 Rop GTPase 信号转换介导的。与细胞壁形态建成相关的多聚糖和酶需要大量的微丝为其从高尔基体准确运输至细胞壁提供广泛的运输通道和方向, 微管则通过其正端与这些多聚糖和酶结合来决定它们的最终定位［５］。通常, 植物细胞的极性生长有弥性生长（diffuse growth）和顶端生长（tip growth）两种机制。在顶端生长机制中，细胞生长只限制于一个很小的区域，主要依赖于微丝骨架，微管骨架的作用很小，根毛和花粉管的生长采用这种机制。相比而言，更多的细胞型采用弥散性生长模式。在这种机制中，细胞的伸长主要依靠微管重排和膨压的驱动，微丝的作用较小。但相同的是，两种模式下，微管起着建立和维持生长极性的作用，而微丝负责将生长所需物质运输到特定位点［６］。
棉纤维细胞伸长的模式尚未最后确定，并仍是这领域的科学家研究的一个课题。单向和快速增长的细胞，如花粉管、根毛、叶毛和真菌菌丝遵循顶端生长的模式，从而限制了扩展到圆顶式的顶端区域。然而快速伸长的纤维细胞，似乎通过弥散性生长方式。最近研究表明，棉花纤维细胞生长是顶端生长和弥散性生长结合的线性生长模式［７］。在顶端生长模式中，线粒体、高尔基体、内质网呈带状分布在有很多分泌囊泡聚集的靠近细胞顶端的部位，微管沿着细胞纵轴呈捆绑排列；在弥散性生长模式中，没有清晰的带状分布，而且，微管呈横向排列。在线性生长模式中，只有在次生壁累积的细胞部分，微管才相对于生长轴呈横向排列。在细胞顶端部分，能够观察到高浓度的Ca２＋、ROS和分泌囊泡，然而这通常跟顶端生长有关。由此可见，在棉纤维生长模式中，细胞骨架起着重要的作用。
近年来，对细胞骨架在棉花纤维发育中的作用研究很多，尤其是微管在棉花纤维发育中的作用研究开展比较多，目前已经分析了795个tubulin表达序列标签，从棉花cDNA文库克隆了19个βtubulin基因（TUB）。其中9个GhTUBs在伸长的纤维细胞高表达，而且每个基因可以被不同的药物诱导：赤霉素（gibberellin）可以诱导GhTUB1和GhTUB3的表达，乙烯（ethylene）可以诱导GhTUB5、GhTUB9和GhTUB12的表达，油菜素内酯（brassinosteroid?）可以诱导GhTUB1、 GhTUB3、 GhTUB9和GhTUB12的表达，木蜡酸（lignoceric acid）可以诱导GhTUB1、 GhTUB3、GhTUB12的表达。这些基因编码的蛋白质参与调节棉花纤维发育［８］。通过对棉花纤维发育突变体基因表达谱分析，发现微丝功能的异常可能与棉花纤维发育异常有关。因此，微丝可能也参与了棉花纤维发育调控，微丝结合蛋白通过调控微丝的动态结构从而调控细胞的基因的功能。但是微丝、微管结构的变化与棉花纤维细胞伸长的关系仍然没有完全被揭示。
大量的可以干扰细胞骨架的化学药品，可用于研究处于生长发育阶段的棉花纤维的细胞骨架动力学性质，研究微丝、微管对于棉花纤维发育的作用。Jasplakinolide，是海绵Jaspis johnstoni的大环肽天然产物，在离体培养条件下可以结合到Factin上，诱导actin聚合［９］。红海海绵素B（Latrunculin B），是从红海海绵Latrunculia magnifica中纯化出来的包含14个组成成分的一种大环内酯类毒素，可以与actin单体结合，起到隔离actin单体的作用，最后使微丝解聚，改变微丝的结构［１０］。细胞松弛素（Cytochalasin）是一组真菌的代谢产物，可与细胞内微丝结合后可以将微丝切断，并结合在微丝末端阻抑肌动蛋白在该部位的聚合，但对微丝的解聚没有明显影响，因而用细胞松弛素处理的细胞可以破坏微丝的网格结构，并阻止细胞的运动，影响微丝组装。其中，细胞松弛素 D（CytochalasinＤ）比下包松弛素B（Cytochalasin B）更有效［１１］。紫杉醇（Taxol），是从红豆杉中提取出来的一种植物碱。紫杉醇能够减少微管组装的时间，减少了组装所必需的微管蛋白的关键浓度［１２］。氨磺乐灵（Oryzalin），是二硝基苯胺家族的一种除草剂，可以特异性地引起植物微管的解聚，对高等植物微管活性有直接的毒性［１３］。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1植物材料3
1.1.2主要试剂3
1.1.3培养基配方3
1.2方法 4
1.2.1胚珠离体培养4
1.2.2胚珠和纤维发育的观察4
1.2.3微丝骨架结构的观察4
2结果与分析4
2.1微丝作用药物对棉花离体培养胚珠纤发育的影响4
2.1.1 Jasplakinolide对棉花离体培养胚珠纤维发育的影响4
2.1.2红海海绵素B对棉花离体培养胚珠纤维发育的影响6
2.1.3 细胞松弛素 D对棉花离体培养胚珠纤维发育的影响8
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2微管作用药物对棉花离体培养胚珠纤发育的影响11
2.2.1紫杉醇对棉花离体培养胚珠纤维发育的影响10
2.2.2 氨磺乐灵对棉花离体培养胚珠纤维发育的影响11
3讨论 13
致谢13
参考文献14
细胞骨架作用药物对离体培养棉花胚珠纤维发育的影响
引言
棉花纤维是最重要的天然纤维，是纺织工业的原料，广泛应用于医疗、汽车、电子行业。棉纤维细胞是由胚珠外珠被表皮细胞分化而成的，单细胞纤维，是高等植物中伸长最快、合成纤维素最多的模式单细胞［１］。根据细胞结构、功能、基因表达变化特征的不同，棉花纤维发育可划分为分化、伸长、次生壁加厚以及细胞成熟四个既相互不同又有部分重叠的发育阶段［２］。
细胞骨架（cytoskeleton, CSK）是位于细胞膜内侧面的蛋白质丝纤维网架系统。细胞架由微管（microtubule）、微丝（microfilament）和中间纤维（intermediate filament）共同构成。微管主要由α、β微管蛋白（tubulin)和少量的微管结合蛋白（microtubule associated protein, MAP）构成，它们具有集结成是25nm左右的管状纤维的功能［３］。微丝是由肌动蛋白（actin）的亚单位组成的螺旋状结构,有极性。肌动蛋白以两种形态存在,聚合态纤维肌动蛋白（Factin）及可溶性球状肌动蛋白（Gactin），两种形态的肌动蛋白之间存在着动态平衡，但只有聚合态肌动蛋白才具有生物学作用［４］。
植物细胞的形态建成是细胞壁形成及细胞生长分化的结果, 这一过程需要由微管和微丝骨架共同调节，且微管和微丝的这种协调作用是通过 Rop GTPase 信号转换介导的。与细胞壁形态建成相关的多聚糖和酶需要大量的微丝为其从高尔基体准确运输至细胞壁提供广泛的运输通道和方向, 微管则通过其正端与这些多聚糖和酶结合来决定它们的最终定位［５］。通常, 植物细胞的极性生长有弥性生长（diffuse growth）和顶端生长（tip growth）两种机制。在顶端生长机制中，细胞生长只限制于一个很小的区域，主要依赖于微丝骨架，微管骨架的作用很小，根毛和花粉管的生长采用这种机制。相比而言，更多的细胞型采用弥散性生长模式。在这种机制中，细胞的伸长主要依靠微管重排和膨压的驱动，微丝的作用较小。但相同的是，两种模式下，微管起着建立和维持生长极性的作用，而微丝负责将生长所需物质运输到特定位点［６］。
棉纤维细胞伸长的模式尚未最后确定，并仍是这领域的科学家研究的一个课题。单向和快速增长的细胞，如花粉管、根毛、叶毛和真菌菌丝遵循顶端生长的模式，从而限制了扩展到圆顶式的顶端区域。然而快速伸长的纤维细胞，似乎通过弥散性生长方式。最近研究表明，棉花纤维细胞生长是顶端生长和弥散性生长结合的线性生长模式［７］。在顶端生长模式中，线粒体、高尔基体、内质网呈带状分布在有很多分泌囊泡聚集的靠近细胞顶端的部位，微管沿着细胞纵轴呈捆绑排列；在弥散性生长模式中，没有清晰的带状分布，而且，微管呈横向排列。在线性生长模式中，只有在次生壁累积的细胞部分，微管才相对于生长轴呈横向排列。在细胞顶端部分，能够观察到高浓度的Ca２＋、ROS和分泌囊泡，然而这通常跟顶端生长有关。由此可见，在棉纤维生长模式中，细胞骨架起着重要的作用。
近年来，对细胞骨架在棉花纤维发育中的作用研究很多，尤其是微管在棉花纤维发育中的作用研究开展比较多，目前已经分析了795个tubulin表达序列标签，从棉花cDNA文库克隆了19个βtubulin基因（TUB）。其中9个GhTUBs在伸长的纤维细胞高表达，而且每个基因可以被不同的药物诱导：赤霉素（gibberellin）可以诱导GhTUB1和GhTUB3的表达，乙烯（ethylene）可以诱导GhTUB5、GhTUB9和GhTUB12的表达，油菜素内酯（brassinosteroid?）可以诱导GhTUB1、 GhTUB3、 GhTUB9和GhTUB12的表达，木蜡酸（lignoceric acid）可以诱导GhTUB1、 GhTUB3、GhTUB12的表达。这些基因编码的蛋白质参与调节棉花纤维发育［８］。通过对棉花纤维发育突变体基因表达谱分析，发现微丝功能的异常可能与棉花纤维发育异常有关。因此，微丝可能也参与了棉花纤维发育调控，微丝结合蛋白通过调控微丝的动态结构从而调控细胞的基因的功能。但是微丝、微管结构的变化与棉花纤维细胞伸长的关系仍然没有完全被揭示。
大量的可以干扰细胞骨架的化学药品，可用于研究处于生长发育阶段的棉花纤维的细胞骨架动力学性质，研究微丝、微管对于棉花纤维发育的作用。Jasplakinolide，是海绵Jaspis johnstoni的大环肽天然产物，在离体培养条件下可以结合到Factin上，诱导actin聚合［９］。红海海绵素B（Latrunculin B），是从红海海绵Latrunculia magnifica中纯化出来的包含14个组成成分的一种大环内酯类毒素，可以与actin单体结合，起到隔离actin单体的作用，最后使微丝解聚，改变微丝的结构［１０］。细胞松弛素（Cytochalasin）是一组真菌的代谢产物，可与细胞内微丝结合后可以将微丝切断，并结合在微丝末端阻抑肌动蛋白在该部位的聚合，但对微丝的解聚没有明显影响，因而用细胞松弛素处理的细胞可以破坏微丝的网格结构，并阻止细胞的运动，影响微丝组装。其中，细胞松弛素 D（CytochalasinＤ）比下包松弛素B（Cytochalasin B）更有效［１１］。紫杉醇（Taxol），是从红豆杉中提取出来的一种植物碱。紫杉醇能够减少微管组装的时间，减少了组装所必需的微管蛋白的关键浓度［１２］。氨磺乐灵（Oryzalin），是二硝基苯胺家族的一种除草剂，可以特异性地引起植物微管的解聚，对高等植物微管活性有直接的毒性［１３］。
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