小麦赤霉病菌β2微管蛋白e198a突变型对多菌灵的抗药性调控研究
[目的]通过体外人工点突变和两步同源置换法研究小麦赤霉病菌β2-微管蛋白E198A突变基因型是否导致对多菌灵产生抗药性，进一步完善不同植物病原菌对多菌灵的抗药性机制。[方法]构建小麦赤霉病菌β2-微管蛋白E198A突变基因型人工点突变载体，以小麦赤霉病菌β2-微管蛋白基因缺失突变体Δβ2-23为出发菌株，将构建的人工点突变载体同源置换到β2-微管蛋白基因位点，通过潮霉素含药板和f2du含药板对转化子进行筛选，并对其进行PCR、Southern blot和测序验证，得到目的突变体，最后采用菌丝生长抑制法对突变体进行表型测定。[结果]经验证获得的E198A突变体对多菌灵表现高水平抗性，菌丝生长、产孢能力和致病力与野生型菌株2021没有显著差异。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1供试菌株及试剂 2
1.1.1菌株 2
1.1.2 培养基 2
1.2 禾谷镰孢菌分子生物学操作方法 2
1.2.1禾谷镰孢菌基因组DNA提取（CTAB法） 2
1.2.2 原生质体的制备与转化 2
1.2.3 分生孢子悬浮液的制备 3
1.3 β2微管蛋白基因体外人工点突变 3
1.3.1人工点突变载体的构建 3
1.3.2基于同源置换法点突变β2微管蛋白基因 4
1.3.3 突变体的验证 4
1.4突变体的生物学特性测定 6
1.4.1 对多菌灵的药敏性测定 6
1.4.2 菌丝生长速率及菌落形态观察 7
1.4.3 致病力测定 7
1.4.4产孢量测定 7
2 结果与分析 7
2.1载体构建 7
2.2 突变体的验证 7
2.2.1药剂验证 7
2.2.2 PCR验证 8
2.2.3 Southern blot杂交验证 9
2.3 突变体的生物学特性 9
2.3.1 突变体对多菌灵的敏感性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
9
2.3.2 突变体菌丝生长速率及菌落形态 9
2.3.3 突变体的致病力 10
2.3.4产孢能力 11
3 讨论 11
致谢 11
参考文献： 12
小麦赤霉病菌β2微管蛋白E198A突变型对多菌灵的抗药性调控研究
引言
引言 小麦赤霉病是国内外威胁小麦生产安全的主要流行病害之一，它由多种镰孢菌引起，优势种为禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）。小麦赤霉病不但会导致小麦产量降低，其病原菌还会在病粒中分泌脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON毒素），造成对人和牲畜的毒害作用，严重威胁着食品安全和人类的健康[1]。对于小麦赤霉病的防治，选育抗病品种被认为是最有效且最经济的措施，但是由于目前尚未培育出对赤霉病完全免疫的抗病品种，生产上应用的品种多为中度抗性品种，缺乏对具有高抗的小麦种子资源。因此，在扬花期施用化学药剂仍然是防治该病的一项应急措施。自上世纪70年代以来，我国防治小麦赤霉病使用的主要药剂是以多菌灵为主的苯并咪唑类杀菌剂，但随着该类药剂使用频率的增大及使用年限的增加，小麦赤霉病菌已对多菌灵产生抗药性，且抗性范围逐年扩大，抗性比例逐年上升，从而导致赤霉病防效丧失，病害抗药性流行加剧。
大学杀菌剂生物学实验室通过多年的研究证实，小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性是由其β2微管蛋白基因的密码子发生突变造成，目前已报道的位点包括6、50、165、167、198、200、241和257位[2]。大学周明国教授研究小组发现，禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因第E198K（第198位氨基酸突变GluLys）位点突变可导致该菌对多菌灵高抗，第E198Q（第198位氨基酸突变Glu Gln）位点突变可导致该菌对多菌灵低抗[3]，第E198L（第198位氨基酸突变GluLeu）位点突变可导致该菌对多菌灵高抗[4]。而在灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对多菌灵的抗药性研究中发现，灰葡萄孢菌β微管蛋白基因第E198A（第198位氨基酸突变GluAla）位突变体对多菌灵表现高水平抗性[5]，于是我们大胆提出猜想，禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因第E198A位突变体是否也可以对多菌灵产生抗性。本文利用定点突变技术和同源置换法构造了禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因第E198A位突变体，通过测定E198A突变体对多菌灵的敏感性来确定该位点与抗药性的关系。
1 材料与方法
1.1供试菌株及试剂
1.1.1菌株
表1 本实验所用菌株
菌株
相关特性
来源
2021
野生型菌株，对多菌灵敏感
实验室保存
Δβ223
β2c1
2021菌株β2微管蛋白基因敲除体
Δβ223菌株β2微管蛋白基因回复体
实验室保存
实验室保存
1.1.2 培养基
表2 本实验所用培养基
培养基
配方（1L）
用途
PDA
土豆（煮沸去渣）200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g
菌落培养
YEPD
蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母提取物3g
摇培菌丝
绿豆汤
30g绿豆（煮到绿豆微微开裂，然后过滤）
摇培孢子体
再生培养基
水解酪蛋白1g，酵母提取物1g，蔗糖1M，琼脂粉16g
筛选转化子
覆盖培养基
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1供试菌株及试剂 2
1.1.1菌株 2
1.1.2 培养基 2
1.2 禾谷镰孢菌分子生物学操作方法 2
1.2.1禾谷镰孢菌基因组DNA提取（CTAB法） 2
1.2.2 原生质体的制备与转化 2
1.2.3 分生孢子悬浮液的制备 3
1.3 β2微管蛋白基因体外人工点突变 3
1.3.1人工点突变载体的构建 3
1.3.2基于同源置换法点突变β2微管蛋白基因 4
1.3.3 突变体的验证 4
1.4突变体的生物学特性测定 6
1.4.1 对多菌灵的药敏性测定 6
1.4.2 菌丝生长速率及菌落形态观察 7
1.4.3 致病力测定 7
1.4.4产孢量测定 7
2 结果与分析 7
2.1载体构建 7
2.2 突变体的验证 7
2.2.1药剂验证 7
2.2.2 PCR验证 8
2.2.3 Southern blot杂交验证 9
2.3 突变体的生物学特性 9
2.3.1 突变体对多菌灵的敏感性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
9
2.3.2 突变体菌丝生长速率及菌落形态 9
2.3.3 突变体的致病力 10
2.3.4产孢能力 11
3 讨论 11
致谢 11
参考文献： 12
小麦赤霉病菌β2微管蛋白E198A突变型对多菌灵的抗药性调控研究
引言
引言 小麦赤霉病是国内外威胁小麦生产安全的主要流行病害之一，它由多种镰孢菌引起，优势种为禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）。小麦赤霉病不但会导致小麦产量降低，其病原菌还会在病粒中分泌脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON毒素），造成对人和牲畜的毒害作用，严重威胁着食品安全和人类的健康[1]。对于小麦赤霉病的防治，选育抗病品种被认为是最有效且最经济的措施，但是由于目前尚未培育出对赤霉病完全免疫的抗病品种，生产上应用的品种多为中度抗性品种，缺乏对具有高抗的小麦种子资源。因此，在扬花期施用化学药剂仍然是防治该病的一项应急措施。自上世纪70年代以来，我国防治小麦赤霉病使用的主要药剂是以多菌灵为主的苯并咪唑类杀菌剂，但随着该类药剂使用频率的增大及使用年限的增加，小麦赤霉病菌已对多菌灵产生抗药性，且抗性范围逐年扩大，抗性比例逐年上升，从而导致赤霉病防效丧失，病害抗药性流行加剧。
大学杀菌剂生物学实验室通过多年的研究证实，小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性是由其β2微管蛋白基因的密码子发生突变造成，目前已报道的位点包括6、50、165、167、198、200、241和257位[2]。大学周明国教授研究小组发现，禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因第E198K（第198位氨基酸突变GluLys）位点突变可导致该菌对多菌灵高抗，第E198Q（第198位氨基酸突变Glu Gln）位点突变可导致该菌对多菌灵低抗[3]，第E198L（第198位氨基酸突变GluLeu）位点突变可导致该菌对多菌灵高抗[4]。而在灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对多菌灵的抗药性研究中发现，灰葡萄孢菌β微管蛋白基因第E198A（第198位氨基酸突变GluAla）位突变体对多菌灵表现高水平抗性[5]，于是我们大胆提出猜想，禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因第E198A位突变体是否也可以对多菌灵产生抗性。本文利用定点突变技术和同源置换法构造了禾谷镰孢菌β2微管蛋白基因第E198A位突变体，通过测定E198A突变体对多菌灵的敏感性来确定该位点与抗药性的关系。
1 材料与方法
1.1供试菌株及试剂
1.1.1菌株
表1 本实验所用菌株
菌株
相关特性
来源
2021
野生型菌株，对多菌灵敏感
实验室保存
Δβ223
β2c1
2021菌株β2微管蛋白基因敲除体
Δβ223菌株β2微管蛋白基因回复体
实验室保存
实验室保存
1.1.2 培养基
表2 本实验所用培养基
培养基
配方（1L）
用途
PDA
土豆（煮沸去渣）200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g
菌落培养
YEPD
蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母提取物3g
摇培菌丝
绿豆汤
30g绿豆（煮到绿豆微微开裂，然后过滤）
摇培孢子体
再生培养基
水解酪蛋白1g，酵母提取物1g，蔗糖1M，琼脂粉16g
筛选转化子
覆盖培养基
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/216.html
