转mag1166基因的抗病性鉴定和分子检测
赤霉病是一种灾难性的小麦病害，流行年份往往造成严重损失，受侵染的籽粒中还会产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇等毒素，危害人畜健康。本研究通过单花滴注法和喷雾法将赤霉菌接种到小麦后观察表型的方法对新基因MAG1166在抗侵入和抗扩展两方面的抗病功能进行了鉴定与分子分析。结果表明，转基因材料和受体Y158材料之间在抗扩展方面没有显著差异，在抗侵入方面14天时有显著差异，21天时没有显著差异。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法6
1.1植物材料和菌体材料6
1.2转基因植株分子鉴定.....................6
1.2.1小麦基因组DNA的提取..................6
1.2.2赤霉菌小种混合悬浮液的制备...6
1.2. 3 PCR鉴定...................................................................................................................6
1.3赤霉病抗性鉴定7
1.3.1单花滴注法接菌......7
1.3.2喷雾法接菌........................7
2结果与分析7
2.1 MAG1166转基因植株的鉴定.7
2.2 MAG1166转基因植株抗病性鉴定8
3讨论.......9
致谢10
参考文献10
转MAG1166基因的抗病性鉴定和分子分析
引言
小麦是世界上种植面积最大、总产量最高的粮食作物之一，产量仅次于水稻和玉米，位于第三位。因此，小麦高产、稳产对于保障粮食安全具有重要的意义。小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是由玉蜀黍赤霉引起的仅次于小麦锈病的第二大病害，广泛发生于温暖潮湿和半潮湿地区，在中国长江中下游和华南冬麦区及东北春麦区尤为严重[1]，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
是影响中国小麦生产的重要病害[2][3]。小麦感染赤霉病后，不仅产量和品质降低，引起小麦赤霉病的的禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)在侵染小麦的过程中产生如脱氧雪腐镰刀烯醇(trichothecene deoxynivalenol，DON)等真菌毒素严重影响人畜健康[4]。
赤霉病小麦的各个时期都可能发生，在我国以穗腐危害最为严重，主要发生于小麦生育后期，若温度、湿度、光照、风力等环境因素都适宜，即可引起赤霉病的发生[5]。小麦穗部被赤霉菌侵染后通常是12个小穗被害，一个小穗发病后会向上向下蔓延危害临近小穗，还会深入穗轴内部，引起穗轴坏死。转MAG1166基因的抗病性鉴定就是在5月份小麦抽穗后，对穗部进行接种，鉴定该基因的抗病性。
小麦从苗期至成熟期都能感染赤霉病，以花期最为显著。Kang et al[6][7][8] 和Carin et al[9] 分别利用免疫电镜和激光共聚焦显微成像技术观察赤霉病菌侵染小麦穗部的过程。在温度、湿度、光照、风力等环境因素都适宜的条件下，对小麦进行接种3648个小时后，真菌孢子萌发产生的菌丝体密集的分布于小穗颖片、外稃、内稃的内侧和子房表面，由于小麦花药含有促进禾谷镰刀菌生长发育的物质[10],所以在花药残留的区域，菌丝分布更加密集。密布于穗部器官表面的菌丝体会分泌各种水解酶类，软化寄主细胞壁，随后穿透进入小麦组织中，从而完成侵入过程。侵入穗部的菌丝体在穗轴内沿维管束组织和皮层组织向上和向下扩展，延伸到相邻小花，随着菌丝在小麦穗部组织内不断地生长扩展，使得寄主细胞坏死、解体，并最后导致整个麦穗的枯死[4] [11][12][13][14][15][16]。
研究者经过长期观察研究，将小麦对赤霉病的抗性分为五种类型：抗侵入、抗扩展、脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)等毒素的积累或降解毒素能力、降低病粒率和耐病性，其中抗侵入和抗扩展是两种最主要的类型[17]。抗侵入反映的是小麦抵抗赤霉菌初侵染的能力，而抗扩展反映的是在赤霉菌侵染后宿主抵御其通过菌丝生长沿着穗轴延伸的能力。从表型上看，两者具有完全不同的抗性机制，所采用的接种鉴定方法和鉴定指标也有很大差异；从遗传上看，这两种抗性分别由一套基本上互不相同的基因控制[18][19]。针对不同抗病类型需要不同的鉴定方法和抗病指标[20]，田间撒病粒接种、悬浮孢子液喷雾接种、小穗单花滴注接种、剪颖滴菌液接种、离体麦穗接种以及离体叶片接种等方法[21]，其中前三种方法在后来的抗赤霉病研究中应用较多。转MAG1166基因抗病性鉴定主要是对小麦抗侵入与抗扩展两方面赤霉病抗性鉴定，喷雾赤霉菌小种混合悬浮液是鉴定抗侵入抗性最常用的方法，接种后将病穗率、病情严重度和病情指数作为抗性鉴定指标。单花滴注法接种病原菌是鉴定抗扩展抗性最常用的方法，主要以病小穗率、病轴长度、穗轴发病时间、穗轴病节片数作为抗扩展鉴定指标[22]。
为了有效预防和控制赤霉病，种质资源的利用非常重要，小麦赤霉病抗性的种质资源主要有三类，来自亚洲的春小麦、来自东欧的冬小麦和意大利和巴西的春小麦品种，但至今还没有寻找到免疫品种。小麦抗赤霉病品种改良可以采用系统选育，由于中国许多地区都有赤霉病的发生，存在着自然选择压[23]，因此通过小麦品种长期对病害的适应性，筛选出不少抗病的地方品种，这些品种的抗性强且持久，但农艺性状较差，对育成品种的产量影响较大，可以通过单株选择，从推广品种中选育一些较抗病品种。也可以通过杂交选育，利用感病亲本杂交，扬州地区农科所从南大2419/胜利麦/阿夫组合中育成了“扬麦4号”，原始亲本是感病或中感病品种，但可能由于抗病基因的突变、累加和重组而出现超亲遗传，可以利用已有抗源进行杂交进一步选育出抗病品种。也可以利用太谷核不育基因进行选育，吴兆苏等提出了“小麦抗赤霉病基因库的建拓”的育种方案[24]。这种基因库是利用小麦显性雄性不育基因Tal(MS2),通过多亲本聚合杂交和表型混合选择与后代测定选择相结合的轮回选择来建拓。在任何轮选周期均可将不同的新资源导入基因库使之继续得到开拓,而基因库中的各种优良基因也可陆续被提取以发展为新良种。然而大多数高抗品系与中国的抗源有着或近或远的亲缘关系，抗源谱过于狭窄对抗病育种有着诸多不利影响[25]。除了常规的育种方法，研究小麦赤霉病抗性还会用到主效QTL定位的方法，不同抗源可能存在不同的抗性基因,利用不同遗传群体进行QTL定位和分子作图有利于获得不同抗性QTL的分子标记,利用标记辅助选择可在小麦抗病育种中聚合不同的抗性基因以提高育成材料的抗病性[26]。但是过程繁琐，耗时较长，相对而言通过转基因提高小麦赤霉病抗性操作简单且耗时较短。本课题的研究对象是以推广品种扬麦158为背景得到的转基因植株群体，并以扬麦158为对照鉴定该基因是否具有小麦赤霉病抗性。
植物的抗病性往往受到抗病基因的调控，与抗赤霉病相关的基因大致可以分为六类，第一类是防卫反应基因，即当植物受到病原菌侵染后，会迅速表达积累病程相关蛋白（pathogenesisrelated protein，PR protein）。几丁质酶和葡聚糖酶等在小麦抗赤霉病转基因研究中应用较为广泛。叶兴国等利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和β1,3葡聚糖酶基因导入小麦品种扬麦10和Bobwhite。T1代单花接种鉴定表明，转基因株系对赤霉病具有一定抗性，病小穗病率为4.76%～11.76%，显著低于抗病对照苏麦3号（16.56%）[27]。第二类是植物抗病相关调控因子，Makandar[28]等将NPR1基因导入小麦模式品种Bobwhite，赋予其可遗传的抗赤霉病扩展能力，其抗性的获得与NPR1基因快速激活植物抗病反应相关。第三类是抗菌肽，Li[29]等将来源与萝卜的抗菌肽 Rs AFP2 转化小麦品种扬麦12，经单花接种和喷雾接种鉴定，赤霉病抗性显著高于非转基因受体对照材料。第四类是抗体融合蛋白，第五类是抗毒素和降解毒素相关的基因，第六类是其他类型抗真菌蛋白。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法6
1.1植物材料和菌体材料6
1.2转基因植株分子鉴定.....................6
1.2.1小麦基因组DNA的提取..................6
1.2.2赤霉菌小种混合悬浮液的制备...6
1.2. 3 PCR鉴定...................................................................................................................6
1.3赤霉病抗性鉴定7
1.3.1单花滴注法接菌......7
1.3.2喷雾法接菌........................7
2结果与分析7
2.1 MAG1166转基因植株的鉴定.7
2.2 MAG1166转基因植株抗病性鉴定8
3讨论.......9
致谢10
参考文献10
转MAG1166基因的抗病性鉴定和分子分析
引言
小麦是世界上种植面积最大、总产量最高的粮食作物之一，产量仅次于水稻和玉米，位于第三位。因此，小麦高产、稳产对于保障粮食安全具有重要的意义。小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是由玉蜀黍赤霉引起的仅次于小麦锈病的第二大病害，广泛发生于温暖潮湿和半潮湿地区，在中国长江中下游和华南冬麦区及东北春麦区尤为严重[1]，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
是影响中国小麦生产的重要病害[2][3]。小麦感染赤霉病后，不仅产量和品质降低，引起小麦赤霉病的的禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)在侵染小麦的过程中产生如脱氧雪腐镰刀烯醇(trichothecene deoxynivalenol，DON)等真菌毒素严重影响人畜健康[4]。
赤霉病小麦的各个时期都可能发生，在我国以穗腐危害最为严重，主要发生于小麦生育后期，若温度、湿度、光照、风力等环境因素都适宜，即可引起赤霉病的发生[5]。小麦穗部被赤霉菌侵染后通常是12个小穗被害，一个小穗发病后会向上向下蔓延危害临近小穗，还会深入穗轴内部，引起穗轴坏死。转MAG1166基因的抗病性鉴定就是在5月份小麦抽穗后，对穗部进行接种，鉴定该基因的抗病性。
小麦从苗期至成熟期都能感染赤霉病，以花期最为显著。Kang et al[6][7][8] 和Carin et al[9] 分别利用免疫电镜和激光共聚焦显微成像技术观察赤霉病菌侵染小麦穗部的过程。在温度、湿度、光照、风力等环境因素都适宜的条件下，对小麦进行接种3648个小时后，真菌孢子萌发产生的菌丝体密集的分布于小穗颖片、外稃、内稃的内侧和子房表面，由于小麦花药含有促进禾谷镰刀菌生长发育的物质[10],所以在花药残留的区域，菌丝分布更加密集。密布于穗部器官表面的菌丝体会分泌各种水解酶类，软化寄主细胞壁，随后穿透进入小麦组织中，从而完成侵入过程。侵入穗部的菌丝体在穗轴内沿维管束组织和皮层组织向上和向下扩展，延伸到相邻小花，随着菌丝在小麦穗部组织内不断地生长扩展，使得寄主细胞坏死、解体，并最后导致整个麦穗的枯死[4] [11][12][13][14][15][16]。
研究者经过长期观察研究，将小麦对赤霉病的抗性分为五种类型：抗侵入、抗扩展、脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)等毒素的积累或降解毒素能力、降低病粒率和耐病性，其中抗侵入和抗扩展是两种最主要的类型[17]。抗侵入反映的是小麦抵抗赤霉菌初侵染的能力，而抗扩展反映的是在赤霉菌侵染后宿主抵御其通过菌丝生长沿着穗轴延伸的能力。从表型上看，两者具有完全不同的抗性机制，所采用的接种鉴定方法和鉴定指标也有很大差异；从遗传上看，这两种抗性分别由一套基本上互不相同的基因控制[18][19]。针对不同抗病类型需要不同的鉴定方法和抗病指标[20]，田间撒病粒接种、悬浮孢子液喷雾接种、小穗单花滴注接种、剪颖滴菌液接种、离体麦穗接种以及离体叶片接种等方法[21]，其中前三种方法在后来的抗赤霉病研究中应用较多。转MAG1166基因抗病性鉴定主要是对小麦抗侵入与抗扩展两方面赤霉病抗性鉴定，喷雾赤霉菌小种混合悬浮液是鉴定抗侵入抗性最常用的方法，接种后将病穗率、病情严重度和病情指数作为抗性鉴定指标。单花滴注法接种病原菌是鉴定抗扩展抗性最常用的方法，主要以病小穗率、病轴长度、穗轴发病时间、穗轴病节片数作为抗扩展鉴定指标[22]。
为了有效预防和控制赤霉病，种质资源的利用非常重要，小麦赤霉病抗性的种质资源主要有三类，来自亚洲的春小麦、来自东欧的冬小麦和意大利和巴西的春小麦品种，但至今还没有寻找到免疫品种。小麦抗赤霉病品种改良可以采用系统选育，由于中国许多地区都有赤霉病的发生，存在着自然选择压[23]，因此通过小麦品种长期对病害的适应性，筛选出不少抗病的地方品种，这些品种的抗性强且持久，但农艺性状较差，对育成品种的产量影响较大，可以通过单株选择，从推广品种中选育一些较抗病品种。也可以通过杂交选育，利用感病亲本杂交，扬州地区农科所从南大2419/胜利麦/阿夫组合中育成了“扬麦4号”，原始亲本是感病或中感病品种，但可能由于抗病基因的突变、累加和重组而出现超亲遗传，可以利用已有抗源进行杂交进一步选育出抗病品种。也可以利用太谷核不育基因进行选育，吴兆苏等提出了“小麦抗赤霉病基因库的建拓”的育种方案[24]。这种基因库是利用小麦显性雄性不育基因Tal(MS2),通过多亲本聚合杂交和表型混合选择与后代测定选择相结合的轮回选择来建拓。在任何轮选周期均可将不同的新资源导入基因库使之继续得到开拓,而基因库中的各种优良基因也可陆续被提取以发展为新良种。然而大多数高抗品系与中国的抗源有着或近或远的亲缘关系，抗源谱过于狭窄对抗病育种有着诸多不利影响[25]。除了常规的育种方法，研究小麦赤霉病抗性还会用到主效QTL定位的方法，不同抗源可能存在不同的抗性基因,利用不同遗传群体进行QTL定位和分子作图有利于获得不同抗性QTL的分子标记,利用标记辅助选择可在小麦抗病育种中聚合不同的抗性基因以提高育成材料的抗病性[26]。但是过程繁琐，耗时较长，相对而言通过转基因提高小麦赤霉病抗性操作简单且耗时较短。本课题的研究对象是以推广品种扬麦158为背景得到的转基因植株群体，并以扬麦158为对照鉴定该基因是否具有小麦赤霉病抗性。
植物的抗病性往往受到抗病基因的调控，与抗赤霉病相关的基因大致可以分为六类，第一类是防卫反应基因，即当植物受到病原菌侵染后，会迅速表达积累病程相关蛋白（pathogenesisrelated protein，PR protein）。几丁质酶和葡聚糖酶等在小麦抗赤霉病转基因研究中应用较为广泛。叶兴国等利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和β1,3葡聚糖酶基因导入小麦品种扬麦10和Bobwhite。T1代单花接种鉴定表明，转基因株系对赤霉病具有一定抗性，病小穗病率为4.76%～11.76%，显著低于抗病对照苏麦3号（16.56%）[27]。第二类是植物抗病相关调控因子，Makandar[28]等将NPR1基因导入小麦模式品种Bobwhite，赋予其可遗传的抗赤霉病扩展能力，其抗性的获得与NPR1基因快速激活植物抗病反应相关。第三类是抗菌肽，Li[29]等将来源与萝卜的抗菌肽 Rs AFP2 转化小麦品种扬麦12，经单花接种和喷雾接种鉴定，赤霉病抗性显著高于非转基因受体对照材料。第四类是抗体融合蛋白，第五类是抗毒素和降解毒素相关的基因，第六类是其他类型抗真菌蛋白。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/526.html
