水稻发芽期耐冷性全基因组关联分析0
水稻（Oryza sativa L.）是最主要的三大粮食作物之一，每年在世界范围内约有1,500万公顷的水稻受到低温冷害，低温冷害是水稻减产的主要原因之一。水稻耐冷性状是一个由多基因控制的复杂数量性状，有关水稻发芽期耐冷性基因未见报道。传统的QTL定位方法，需耗费大量的人力物力，随着第二代测序技术的发展，全基因组关联分析已成为研究复杂性状的有效途径。本研究调查了267份水稻自然变异群体在低温下的发芽情况，通过全基因组关联分析，共检测到8个与低温发芽相关的SNPs位点。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
0 引言1
1 材料与方法2
1.1 研究内容2
1.2 可行性分析2
1.3 研究材料3
1.4 研究方法3
2 结果与分析3
2.1 低温处理方法的确定3
2.2 耐冷发芽指数的测定4
2.3 267个水稻自然品种的GWAS分析5
3 讨论6
致谢6
参考文献7
水稻发芽期耐冷性全基因组关联分析
引言
引言
水稻（Oryza sativa L.）是重要的粮食作物之一，其播种面积在世界粮食播种总面积中占20%，年产量约4.8亿吨，占世界粮食总产量的25%。水稻是对15℃以下低温环境比较敏感的作物，全世界每年约有1,500万公顷的水稻在不同生长期，如萌发期、营养生长期、生殖生长期，受到不同程度的低温冷害[1]。近年来，直播水稻在许多亚洲国家得到快速发展，但是在双季稻栽培地区（如中国浙江）[2]、高纬度地区（如日本Hokkaido）[3]和低纬度高海拔地区（如中国云南）[4]播种时，经常会遇到15℃以下低温。低温引起直播水稻烂芽、幼苗生长缓慢，死苗等现象[2]，严重影响水稻产量。因此，挖掘水稻发芽期耐冷相关基因，解析水稻发芽期耐冷机制，培育水稻发芽期耐冷品种，至关重要。
目前，水稻耐冷机制的研究相对较少，控制水稻低温下发芽的基因也只有qLTG31[5]被克隆。在对模式植物拟南芥的研究中发现，拟南芥经过冷
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
驯化（4℃），能够提高拟南芥的抗冻性（0℃以下）[6]。拟南芥冷驯化与含有抗冻分子的在内的一类COR（Cold regulated）基因被诱导表达有关。COR基因的冷诱导表达主要受CBF转录因子家族的三个基因，CBF1、CBF2和CBF3调控。而ICE1、HOS1、CAMTA和SFR1等在基因转录和转录后水平上调控CBF13[7]。此外，植物生长激素也参与了CBF通路[89]。水稻是热带和亚热带作物[10]，拟南芥和一些越冬植物在4℃低温下仍然可以生长，而水稻则不行，这表明水稻与拟南芥对低温的响应以及耐冷机制可能是不同的。
水稻地理和生态分布广泛，遗传多样性丰富，许多胁迫响应机制已有一定的研究，这些条件为水稻发芽期耐冷性的研究奠定了基础。水稻发芽期耐冷性是一个由多基因控制的复杂数量性状。目前，构建分离群体能够有效的定位复杂的数量性状。Fujino[1]以Italica Livorno与Hayamasari为亲本构建BIL群体，定位到主效位点qLTG31，贡献率为35.1%。同时，在3号染色体和4号染色体分别定位到qLTG32、qLTG4，随后又构建NIL精细定位并克隆了qLTG31[5]。Miura报道了五个控制低温发芽的QTL分别位于2、4、5、11号染色体上[11]。HAN构建了F2:3群体，在14℃低温下，分别在7天、11天、14天和17天定位到8个QTL与低温发芽有关[12]。Linfang Li[13]将qLTG9精细定位在72.3Kb的区间，共有5个候选基因，Os09g0395600、Os09g0396300、Os09g0396900、Os09g0395700和Os09g0395800。尽管已有如此多的QTL被发现，但是目前位置仅有qLTG31被克隆，且所有QTL的区间相对较大，很难运用到生产应用上去。
全基因组关联分析（Genome wide association study，GWAS）是研究多样性遗传机制的有效方法。GWAS能够检测全基因组范围的DNA变异与可观测的性状之间是否有遗传关联，最早应用于人类遗传疾病分析。近年来，随着基因组学和生物信息学的快速发展，基因组重测序和SNP（Single nucleotide polymorphism）鉴定成本大大降低，GWAS已开始在植物中得到广泛应用[1417]。与传统QTL连锁分析方法相比，GWAS分析可直接以现有的自然群体为材料，不需要构建作图群体，并且能在全基因组水平同时检测同一基因的多个等位基因。目前利用GWAS已经对拟南芥、水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、油菜等植物的多个性状进行了分析研究，包括小麦籽粒大小与品质[1819]、大豆缺铁失绿性状[20]、棉纤维品质[21]、水稻柱头和颖花性状[22]、油菜形态和籽粒品质[23]、稻米粒色、酚和黄酮含量及抗氧化能力性状[24]、玉米叶片形态构造[25]等。由此可见GWAS是发掘和定位与植物目标性状关联的QTL及等位基因的有效方法。
本研究将鉴定来自82个国家的413份自然群体中的部分材料的的低温下发芽情况，与已发表的44KSNP基因型数据，通过GWAS分析，生物信息学预测，测序等手段，鉴定与低温发芽有关的SNP标记，挖掘耐冷相关基因，从而达到培育水稻发芽期耐冷品种，解析水稻发芽期耐冷机制等目的。
1 材料与方法
1．1 研究内容
本研究拟利用水稻自然变异群体通过全基因组关联分析和新一代测序定位策略来鉴定在水稻发芽期耐冷调控中起关键作用的水稻基因。本研究将测定该自然变异群体在发芽期对低温胁迫的耐受性，进而通过全基因组关联分析(genomewide association study, GWAS)[26]和新一代测序定位(mappingbysequencing)[27]技术鉴定水稻发芽期耐冷的关键基因并研究其生化功能及调控机制。
1．2 可行性分析
GWAS是用来检测全基因组范围的DNA变异与可观测的性状之间的遗传关联的一种分析策略。近年来已有报道成功利用此方法在模式植物拟南芥及玉米、水稻等作物对多种性状进行了研究。随着基因组学以及新型测序分析技术的迅猛发展，GWAS应用日趋广泛，是研究发掘与植物特异性状相关的QTL及基因的有效方法。本研究所用的水稻品种群是稳定的纯合品种并有高密度SNP序列信息，因而它是GWAS研究的理想材料，也并为本实验的成功开展提供了有效保证。基于第二代测序技术的测序定位策略是基因克隆新方法[28]，本实验室利用此方法从拟南芥中成功克隆得到了多个与拟南芥温敏及抗病性相关的基因[27]，因而本实验在理论和技术上都有比较充分的准备。
1．3 研究材料
研究材料名为Rice Diversity Panel，是美国康奈尔大学Susan McCouch教授课题组从世界各地收集分离鉴定的413份稳定纯合体的水稻的自然变异群体。
1．4 研究方法
从这413份稳定纯合的群体中选取267个品种，在低温条件下进行发芽实验，选定芽突破种皮为发芽标准，以发芽指数，一定时间发芽率作为定量数据。产生的定量数据将用来进行GWAS分析，从而找到水稻基因组中与温敏相关的SNPs位点，进而通过生物信息学预测，突变体表型鉴定等方法确定耐冷相关基因，从而更深入解析植物耐冷机制。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
0 引言1
1 材料与方法2
1.1 研究内容2
1.2 可行性分析2
1.3 研究材料3
1.4 研究方法3
2 结果与分析3
2.1 低温处理方法的确定3
2.2 耐冷发芽指数的测定4
2.3 267个水稻自然品种的GWAS分析5
3 讨论6
致谢6
参考文献7
水稻发芽期耐冷性全基因组关联分析
引言
引言
水稻（Oryza sativa L.）是重要的粮食作物之一，其播种面积在世界粮食播种总面积中占20%，年产量约4.8亿吨，占世界粮食总产量的25%。水稻是对15℃以下低温环境比较敏感的作物，全世界每年约有1,500万公顷的水稻在不同生长期，如萌发期、营养生长期、生殖生长期，受到不同程度的低温冷害[1]。近年来，直播水稻在许多亚洲国家得到快速发展，但是在双季稻栽培地区（如中国浙江）[2]、高纬度地区（如日本Hokkaido）[3]和低纬度高海拔地区（如中国云南）[4]播种时，经常会遇到15℃以下低温。低温引起直播水稻烂芽、幼苗生长缓慢，死苗等现象[2]，严重影响水稻产量。因此，挖掘水稻发芽期耐冷相关基因，解析水稻发芽期耐冷机制，培育水稻发芽期耐冷品种，至关重要。
目前，水稻耐冷机制的研究相对较少，控制水稻低温下发芽的基因也只有qLTG31[5]被克隆。在对模式植物拟南芥的研究中发现，拟南芥经过冷
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
驯化（4℃），能够提高拟南芥的抗冻性（0℃以下）[6]。拟南芥冷驯化与含有抗冻分子的在内的一类COR（Cold regulated）基因被诱导表达有关。COR基因的冷诱导表达主要受CBF转录因子家族的三个基因，CBF1、CBF2和CBF3调控。而ICE1、HOS1、CAMTA和SFR1等在基因转录和转录后水平上调控CBF13[7]。此外，植物生长激素也参与了CBF通路[89]。水稻是热带和亚热带作物[10]，拟南芥和一些越冬植物在4℃低温下仍然可以生长，而水稻则不行，这表明水稻与拟南芥对低温的响应以及耐冷机制可能是不同的。
水稻地理和生态分布广泛，遗传多样性丰富，许多胁迫响应机制已有一定的研究，这些条件为水稻发芽期耐冷性的研究奠定了基础。水稻发芽期耐冷性是一个由多基因控制的复杂数量性状。目前，构建分离群体能够有效的定位复杂的数量性状。Fujino[1]以Italica Livorno与Hayamasari为亲本构建BIL群体，定位到主效位点qLTG31，贡献率为35.1%。同时，在3号染色体和4号染色体分别定位到qLTG32、qLTG4，随后又构建NIL精细定位并克隆了qLTG31[5]。Miura报道了五个控制低温发芽的QTL分别位于2、4、5、11号染色体上[11]。HAN构建了F2:3群体，在14℃低温下，分别在7天、11天、14天和17天定位到8个QTL与低温发芽有关[12]。Linfang Li[13]将qLTG9精细定位在72.3Kb的区间，共有5个候选基因，Os09g0395600、Os09g0396300、Os09g0396900、Os09g0395700和Os09g0395800。尽管已有如此多的QTL被发现，但是目前位置仅有qLTG31被克隆，且所有QTL的区间相对较大，很难运用到生产应用上去。
全基因组关联分析（Genome wide association study，GWAS）是研究多样性遗传机制的有效方法。GWAS能够检测全基因组范围的DNA变异与可观测的性状之间是否有遗传关联，最早应用于人类遗传疾病分析。近年来，随着基因组学和生物信息学的快速发展，基因组重测序和SNP（Single nucleotide polymorphism）鉴定成本大大降低，GWAS已开始在植物中得到广泛应用[1417]。与传统QTL连锁分析方法相比，GWAS分析可直接以现有的自然群体为材料，不需要构建作图群体，并且能在全基因组水平同时检测同一基因的多个等位基因。目前利用GWAS已经对拟南芥、水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、油菜等植物的多个性状进行了分析研究，包括小麦籽粒大小与品质[1819]、大豆缺铁失绿性状[20]、棉纤维品质[21]、水稻柱头和颖花性状[22]、油菜形态和籽粒品质[23]、稻米粒色、酚和黄酮含量及抗氧化能力性状[24]、玉米叶片形态构造[25]等。由此可见GWAS是发掘和定位与植物目标性状关联的QTL及等位基因的有效方法。
本研究将鉴定来自82个国家的413份自然群体中的部分材料的的低温下发芽情况，与已发表的44KSNP基因型数据，通过GWAS分析，生物信息学预测，测序等手段，鉴定与低温发芽有关的SNP标记，挖掘耐冷相关基因，从而达到培育水稻发芽期耐冷品种，解析水稻发芽期耐冷机制等目的。
1 材料与方法
1．1 研究内容
本研究拟利用水稻自然变异群体通过全基因组关联分析和新一代测序定位策略来鉴定在水稻发芽期耐冷调控中起关键作用的水稻基因。本研究将测定该自然变异群体在发芽期对低温胁迫的耐受性，进而通过全基因组关联分析(genomewide association study, GWAS)[26]和新一代测序定位(mappingbysequencing)[27]技术鉴定水稻发芽期耐冷的关键基因并研究其生化功能及调控机制。
1．2 可行性分析
GWAS是用来检测全基因组范围的DNA变异与可观测的性状之间的遗传关联的一种分析策略。近年来已有报道成功利用此方法在模式植物拟南芥及玉米、水稻等作物对多种性状进行了研究。随着基因组学以及新型测序分析技术的迅猛发展，GWAS应用日趋广泛，是研究发掘与植物特异性状相关的QTL及基因的有效方法。本研究所用的水稻品种群是稳定的纯合品种并有高密度SNP序列信息，因而它是GWAS研究的理想材料，也并为本实验的成功开展提供了有效保证。基于第二代测序技术的测序定位策略是基因克隆新方法[28]，本实验室利用此方法从拟南芥中成功克隆得到了多个与拟南芥温敏及抗病性相关的基因[27]，因而本实验在理论和技术上都有比较充分的准备。
1．3 研究材料
研究材料名为Rice Diversity Panel，是美国康奈尔大学Susan McCouch教授课题组从世界各地收集分离鉴定的413份稳定纯合体的水稻的自然变异群体。
1．4 研究方法
从这413份稳定纯合的群体中选取267个品种，在低温条件下进行发芽实验，选定芽突破种皮为发芽标准，以发芽指数，一定时间发芽率作为定量数据。产生的定量数据将用来进行GWAS分析，从而找到水稻基因组中与温敏相关的SNPs位点，进而通过生物信息学预测，突变体表型鉴定等方法确定耐冷相关基因，从而更深入解析植物耐冷机制。
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