普通烟草tdna插入突变体库对at(aminotriazole)抗感筛选
烟草T-DNA插入突变体库为研究烟草功能基因组学提供丰富的遗传材料。本研究利用过氧化氢酶抑制剂AT(Aminotriazole)来开展烟草T-DNA插入突变体库的筛选工作。首先，通过两轮外源喷施AT初步筛选得到抗感差异的突变体，然后，利用含有AT的MS培养基进行表型确认，同时，结合T-DNA激活标签载体中的BASTA序列进行转基因植株的阳性鉴定。通过实验，我们从7776个突变体中筛选得到了9个对AT抗感差异明显的阳性突变体，其中3个对AT耐性增强的突变体，编号为18AR（Amitrole Resistant）,19AR和20AR；另外6个突变体相对于野生型对AT更为敏感，依次命名为21AS(Amitrole Sensitive ),22AS,23AS,24AS,25AS,26AS。随后针对耐性增强的突变体19AR进行了灰霉抗性检测实验，发现虽然突变体19AR对AT的耐性增强，但是对灰霉更加敏感。这9个抗感突变体，为后续实验提供了宝贵的研究材料和大致的研究方向，具有重要价值。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料 3
1.1供试植物3
1.2供试菌株3
1.3供试试剂3
1.4供试仪器 3
2方法3
2.1培养基的配制3
2.1.1 MS培养基3
2.1.2 PDA培养基4
2.1.3 V8培养基4
2.2 植物的种植方法 4
2.2.1水培法4
2.2.2土培法4
2.3喷施AT初筛复筛5
2.4 MS培养基验证体系建立5
2.4.1种子消毒方法5
2.4.2 MS平板培养5
2.5 筛选所得突变体的阳性检测5
2.5.1 CTABSDS法提取烟草突变体基因组5
2.5.2 PCR检测原理6
2.5.3 PCR检测反应体系和反应程序6
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/> 2.6灰霉抗感性检测7
2.6.1 接种方法7
2.6.2 抗感性的评价7
3结果7
3.1初筛复筛结果7
3.2 MS验证结果7
3.3 PCR检测结果8
3.4灰霉抗感性检测8
4讨论9
致谢10
参考文献11 普通烟草TDNA插入突变体库对AT(Aminotriazole)抗感筛选
引言
引言
植物生长发育过程中常受到多样性病原物的侵袭，在长期进化过程中，植物逐渐形成一系列复杂而有效的防御机制来抵抗病原菌的侵害。一方面植物可利用自身的特殊结构以及化学成分来进行自身防御；另一方面，植物受到病原物侵染时通过诱导可形成诱导抗性，包括过敏反应（hypersensitive response，HR）和系统获得抗性（systemic acquired resistance，SAR）。HR是植物抗病反应的一种典型症状，其特征是在病原物侵染部位寄主植物细胞迅速局部死亡形成枯斑，导致病原物不易获得营养，从而限制病原物生长和扩散。活性氧迸发（oxidative burst）在激发HR中起着至关重要的作用，也是植物对病原菌应答的最早期反应之一，过氧化氢酶(catalase, CAT)作为防御酶参与其中。
烟草是重要的经济作物，也是植物基因功能研究的模式植物。烟草具有成熟高效的遗传转化体系，而成为功能基因研究的模式受体，但烟草本身的基础科学研究还很薄弱，在烟草基因组计划实施以前，人类对其基因组信息的了解甚少。普通烟草（Nicotiana tabacum）为异源四倍体植物，含T和S两个基因组，其基因组庞大，约4.5 Gb，且重复序列比例高，目前，普通烟草及其两个祖先种绒毛状烟草（N. tomentosiformis）和林烟草（N. sylvestris）的全基因组序列草图已经绘制完成(Sierro et al., 2013; Sierro et al., 2014)，普通烟草三个种TN90、K326、BX的全基因组草图也已经绘制完成，这为利用反向遗传学研究烟草基因功能奠定基础。而随着烟草基因组测序的完成，烟草研究进入功能基因组学的时代，为我们进一步研究烟草提供了便利和基础。
突变体是研究基因功能最直接、最有效的途径之一。基因组测序的完成大大加速了植物功能基因组学研究的平台建设，在全基因组水平上诱发突变的产生以及突变体材料的收集为功能基因组学的研究搭建了平台。利用基因组测序与注释提供的信息，再通过正向或反向遗传学的方法大规模筛选突变，最终实现阐明所有基因功能的目的。TDNA插入已经用于大规模构建了拟南芥突变体库(Alonso et al., 2003; Sessions et al., 2002; Li et al., 2007; Samson et al., 2002; Nishal et al., 2005; Tissier et al., 1999; Ito et al., 2005; Kuromori et al., 2004)和水稻的突变体库(Jeon et al., 2000; Zhang et al., 2006; Sallaud et al., 2004; Miyao et al., 2003; Kolesnik et al., 2004; Hsing et al., 2007; van Enckevort et al., 2005)。通过对插入突变体的分析研究，越来越多的基因生物学功能被挖掘出来。例如不开花基因RID1(Wu et al., 2008)、H3K9去甲基化基因JMJ706(Sun et al., 2008)、ABA合成相关的基因DMS2(Du et al., 2010)，很多其它基因也是通过TDNA插入突变体的筛选而获得(Jeon et al., 2000; Chen et al., 2003; Sallaud et al., 2003; Chern et al., 2007; Tanaka et al., 2008)。
烟草激活标签TDNA插入突变体库为研究烟草功能基因组学提供丰富的遗传材料。其载体携带多聚化的花椰菜花叶病毒35S启动转录增强子（CaMV 35S enhancer），TDNA插入到宿主基因组时，就会干扰宿主内源基因的表达。如果转入的TDNA位于内源基因的上游，就会激活正常情况下沉默的下游基因或者导致该基因的过量或异位表达，导致植物再生长发育、生化代谢等方面的异常，产生功能获得型突变（gainoffunction mutations）而呈现显性表型；如果转入的TDNA位于内源基因的下游，在强启动子的作用下产生大量的反义RNA，从而通过反式作用抑制该基因及其等位基因甚至其它同源序列基因的正常表达，造成基因沉默，产生显性的功能丧失型突变表型（lossoffunction mutations）。由于突变的表型在转化当代就可以表现出来，所以在当代就可以直接选出突变体，无需进行自交等遗传操作。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料 3
1.1供试植物3
1.2供试菌株3
1.3供试试剂3
1.4供试仪器 3
2方法3
2.1培养基的配制3
2.1.1 MS培养基3
2.1.2 PDA培养基4
2.1.3 V8培养基4
2.2 植物的种植方法 4
2.2.1水培法4
2.2.2土培法4
2.3喷施AT初筛复筛5
2.4 MS培养基验证体系建立5
2.4.1种子消毒方法5
2.4.2 MS平板培养5
2.5 筛选所得突变体的阳性检测5
2.5.1 CTABSDS法提取烟草突变体基因组5
2.5.2 PCR检测原理6
2.5.3 PCR检测反应体系和反应程序6
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/> 2.6灰霉抗感性检测7
2.6.1 接种方法7
2.6.2 抗感性的评价7
3结果7
3.1初筛复筛结果7
3.2 MS验证结果7
3.3 PCR检测结果8
3.4灰霉抗感性检测8
4讨论9
致谢10
参考文献11 普通烟草TDNA插入突变体库对AT(Aminotriazole)抗感筛选
引言
引言
植物生长发育过程中常受到多样性病原物的侵袭，在长期进化过程中，植物逐渐形成一系列复杂而有效的防御机制来抵抗病原菌的侵害。一方面植物可利用自身的特殊结构以及化学成分来进行自身防御；另一方面，植物受到病原物侵染时通过诱导可形成诱导抗性，包括过敏反应（hypersensitive response，HR）和系统获得抗性（systemic acquired resistance，SAR）。HR是植物抗病反应的一种典型症状，其特征是在病原物侵染部位寄主植物细胞迅速局部死亡形成枯斑，导致病原物不易获得营养，从而限制病原物生长和扩散。活性氧迸发（oxidative burst）在激发HR中起着至关重要的作用，也是植物对病原菌应答的最早期反应之一，过氧化氢酶(catalase, CAT)作为防御酶参与其中。
烟草是重要的经济作物，也是植物基因功能研究的模式植物。烟草具有成熟高效的遗传转化体系，而成为功能基因研究的模式受体，但烟草本身的基础科学研究还很薄弱，在烟草基因组计划实施以前，人类对其基因组信息的了解甚少。普通烟草（Nicotiana tabacum）为异源四倍体植物，含T和S两个基因组，其基因组庞大，约4.5 Gb，且重复序列比例高，目前，普通烟草及其两个祖先种绒毛状烟草（N. tomentosiformis）和林烟草（N. sylvestris）的全基因组序列草图已经绘制完成(Sierro et al., 2013; Sierro et al., 2014)，普通烟草三个种TN90、K326、BX的全基因组草图也已经绘制完成，这为利用反向遗传学研究烟草基因功能奠定基础。而随着烟草基因组测序的完成，烟草研究进入功能基因组学的时代，为我们进一步研究烟草提供了便利和基础。
突变体是研究基因功能最直接、最有效的途径之一。基因组测序的完成大大加速了植物功能基因组学研究的平台建设，在全基因组水平上诱发突变的产生以及突变体材料的收集为功能基因组学的研究搭建了平台。利用基因组测序与注释提供的信息，再通过正向或反向遗传学的方法大规模筛选突变，最终实现阐明所有基因功能的目的。TDNA插入已经用于大规模构建了拟南芥突变体库(Alonso et al., 2003; Sessions et al., 2002; Li et al., 2007; Samson et al., 2002; Nishal et al., 2005; Tissier et al., 1999; Ito et al., 2005; Kuromori et al., 2004)和水稻的突变体库(Jeon et al., 2000; Zhang et al., 2006; Sallaud et al., 2004; Miyao et al., 2003; Kolesnik et al., 2004; Hsing et al., 2007; van Enckevort et al., 2005)。通过对插入突变体的分析研究，越来越多的基因生物学功能被挖掘出来。例如不开花基因RID1(Wu et al., 2008)、H3K9去甲基化基因JMJ706(Sun et al., 2008)、ABA合成相关的基因DMS2(Du et al., 2010)，很多其它基因也是通过TDNA插入突变体的筛选而获得(Jeon et al., 2000; Chen et al., 2003; Sallaud et al., 2003; Chern et al., 2007; Tanaka et al., 2008)。
烟草激活标签TDNA插入突变体库为研究烟草功能基因组学提供丰富的遗传材料。其载体携带多聚化的花椰菜花叶病毒35S启动转录增强子（CaMV 35S enhancer），TDNA插入到宿主基因组时，就会干扰宿主内源基因的表达。如果转入的TDNA位于内源基因的上游，就会激活正常情况下沉默的下游基因或者导致该基因的过量或异位表达，导致植物再生长发育、生化代谢等方面的异常，产生功能获得型突变（gainoffunction mutations）而呈现显性表型；如果转入的TDNA位于内源基因的下游，在强启动子的作用下产生大量的反义RNA，从而通过反式作用抑制该基因及其等位基因甚至其它同源序列基因的正常表达，造成基因沉默，产生显性的功能丧失型突变表型（lossoffunction mutations）。由于突变的表型在转化当代就可以表现出来，所以在当代就可以直接选出突变体，无需进行自交等遗传操作。
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