烟草中10个细胞膜受体蛋白对xeg1诱导的细胞坏死作用的分析
细胞膜受体蛋白（Pattern Recognition Receptor, PRR）是一类能够识别外界刺激，并能通过传递信号激发植物产生对抗外界刺激的免疫反应，从而使植物免于各种有害微生物的侵染。本文从构建了烟草中十个细胞膜受体蛋白的沉默载体，通过农杆菌注射的方法，将沉默载体转移到烟草中，从而沉默相应的受体蛋白。在沉默的烟草叶片上瞬时表达XEG1蛋白，观察XEG1诱导的烟草叶片的坏死情况，从而判断这10个细胞膜受体蛋白是否参与XEG1诱导的植物细胞坏死。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
疫霉相关简介1
实验方法 2
1．沉默载体的构建2
1.1沉默载体和引物的设计2
1.2聚合酶链式反应PCR2
1.2.1体系的制备2
1.2.2 PCR扩增3
1.3电泳监测3
1.3.1胶的制备3
1.3.2跑胶3
1.4 酶切载体3
1.5 连接3
1.6 大肠杆菌转化3
1.6.1热激转化3
1.6.2电激转化4
1.7菌落PCR4
1.8质粒的提取4
2.烟草接种实验5
2.1农杆菌转化5
2.2农杆菌注射5
2.2.1农杆菌菌液的制备5
2.2.2农杆菌注射5
3.XEG1的瞬时表达5
3.1 RNA的提取：6
3.2 RNA反转录6
3.3定量real time PCR6
3.4蛋白质技术6
3.4.1植物总蛋白的提取操作过程6
3.4.2蛋白质SDSPAGE电泳。7
3.4.3所需试剂的配制7
3.4.4Western7
4.实验过程与结果分析：8
总结与讨论8
参考文献13
致谢14
烟草中10个细胞膜受体蛋白对XEG1诱导的细胞坏死作用的分析
引言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
疫霉相关简介：
疫霉菌是卵菌门中一类能够引起农作物病害的重要病原物，每年对农作物生产造成巨大的损失。在大豆的生产中由大豆疫霉引起的大豆根腐病，每年造成不可估量的损失[1][3]。植物本身并没有如动物一样的适应性免疫系统，对病原菌的防御依靠的是先天免疫系统。植物的先天免疫系统分为两层，第一层是植物利用细胞膜表面受体识别病原物的PAMPs从而产生免疫反应，而第二层是病原物分泌效应分子来帮助病原物侵染，但是植物会产生抗病蛋白来激活植物下游的信号反应从而产生免疫反应。植物与病原物的这种防御，反防御，再防御的模式，构成了植物的先天免疫系统[4][5]。
最近在大豆疫霉菌中鉴定到一个糖苷水解酶家族12(GH12)蛋白—XEG1，具有木葡聚糖酶和β葡聚糖酶的活性[6]。在大豆疫霉侵染植物的过程中，XEG1是重要的毒力因子，表现为XEG1在大豆疫霉中的沉默可严重降低其毒力。此外在大豆(Glycine max)和茄科植物中XEG1也作为病原体相关的分子模式(PAMP)，被多种植物识别并触发防御反应，包括细胞死亡。GH12蛋白广泛分布在微生物类群中，研究表明许多GH12蛋白在烟草中可诱导细胞死亡[6]。虽然XEG1具有木葡聚糖酶和β葡聚糖酶的活性，然而XEG1的引起植物细胞坏死的活性并不依赖于这两个酶活性。此外XEG1诱导的植物细胞坏死依赖于BAK1。研究还发现XEG1在疫霉菌侵染大豆后的早期（30min）内表达量迅速升高，然后慢慢下降。然而XEG1诱导的防御反应可被多种大豆疫霉分泌的RXLR效应蛋白抑制。这项研究表明XEG1一方面有助于增强大豆疫霉菌的毒力，但也可被植物识别诱导免疫反应，这种抗病反应反过来又被疫霉菌的RXLR效应蛋白所抑制。因此，XEG1代表一个质外体效应蛋白，可通过植物的PAMP识别机制而被识别。目前对XEG1是如何被植物识别诱导免疫反应的机理尚不清楚，因此鉴定XEG1的模式识别受体对揭示植物与疫霉菌的互作具有重要意义。
本次研究就是通过基因沉默的方法，将细胞表面受体蛋白相关基因沉默，瞬时表达XEG1后观察植物的坏死反应，判断此次研究的10个受体蛋白是否参与XEG1诱导植物产生免疫反应。
在应用中发现，以TRV为载体的VIGS体系，在抑制转基因和内源基因的表达上，诱导基因沉默的效率和持久性都优于PVX 和TMV 载体，而且TRV比其他病毒的症状轻，对植株造成的伤害小，不会掩盖沉默表型[7]。迄今为止，TRV 病毒载体已在番茄（Solanum lycopersicum）[8]、烟草（Nicotina spp.）[9]、矮牵牛（Petunia hybrida）[10]、辣椒（Capsicum spp.）[11]、拟南芥[12]和棉花（Gossypium spp.）[13]等多种植物上被广泛应用。
农杆菌介导的瞬时表达系统已广泛用于非转基因植物的基因功能研究，它可以更为便捷更为快速地导入外源基因，而且转入基因在短时间内就可表达表达。它的另一个特点是可以在一个叶片组织中同时导入多个基因。由于上述优点，这一研究技术在功能基因组学和蛋白组学研究中发挥巨大的作用。本次实验中运用了农杆菌侵染的方法将细胞膜受体蛋白的基因沉默载体导入到烟草叶片中进行受体基因的沉默。此外，通过农杆菌侵染的方法在烟草叶片中瞬时表达XEG1，并观察XEG1诱导的细胞坏死。
实验方法：
沉默载体的构建
1.1沉默载体和引物的设计
在烟草中找到相应的受体基因序列，寻找每个基因特异的片段（300400 bp）设计引物构建成沉默载体。
1.2 聚合酶链式反应(PCR)
1.2.1体系的制备
因为核酸在溶液状态下容易被降解，所以在网上订购的引物是干粉状态，需要将引物用超纯水溶解成10 uM储存液。将刚送来的干粉进行编号，将干粉分成两份一份备用一份放入离心机中(离心机已配平)，12000 rpm离心2 min，将干粉状的引物甩至管底，防止加水过程中引物损失。缓缓打开离心后的引物管，加入相应的超纯水，每次加完水后需要更换枪头，防止污染，然后放在20℃保存。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
疫霉相关简介1
实验方法 2
1．沉默载体的构建2
1.1沉默载体和引物的设计2
1.2聚合酶链式反应PCR2
1.2.1体系的制备2
1.2.2 PCR扩增3
1.3电泳监测3
1.3.1胶的制备3
1.3.2跑胶3
1.4 酶切载体3
1.5 连接3
1.6 大肠杆菌转化3
1.6.1热激转化3
1.6.2电激转化4
1.7菌落PCR4
1.8质粒的提取4
2.烟草接种实验5
2.1农杆菌转化5
2.2农杆菌注射5
2.2.1农杆菌菌液的制备5
2.2.2农杆菌注射5
3.XEG1的瞬时表达5
3.1 RNA的提取：6
3.2 RNA反转录6
3.3定量real time PCR6
3.4蛋白质技术6
3.4.1植物总蛋白的提取操作过程6
3.4.2蛋白质SDSPAGE电泳。7
3.4.3所需试剂的配制7
3.4.4Western7
4.实验过程与结果分析：8
总结与讨论8
参考文献13
致谢14
烟草中10个细胞膜受体蛋白对XEG1诱导的细胞坏死作用的分析
引言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
疫霉相关简介：
疫霉菌是卵菌门中一类能够引起农作物病害的重要病原物，每年对农作物生产造成巨大的损失。在大豆的生产中由大豆疫霉引起的大豆根腐病，每年造成不可估量的损失[1][3]。植物本身并没有如动物一样的适应性免疫系统，对病原菌的防御依靠的是先天免疫系统。植物的先天免疫系统分为两层，第一层是植物利用细胞膜表面受体识别病原物的PAMPs从而产生免疫反应，而第二层是病原物分泌效应分子来帮助病原物侵染，但是植物会产生抗病蛋白来激活植物下游的信号反应从而产生免疫反应。植物与病原物的这种防御，反防御，再防御的模式，构成了植物的先天免疫系统[4][5]。
最近在大豆疫霉菌中鉴定到一个糖苷水解酶家族12(GH12)蛋白—XEG1，具有木葡聚糖酶和β葡聚糖酶的活性[6]。在大豆疫霉侵染植物的过程中，XEG1是重要的毒力因子，表现为XEG1在大豆疫霉中的沉默可严重降低其毒力。此外在大豆(Glycine max)和茄科植物中XEG1也作为病原体相关的分子模式(PAMP)，被多种植物识别并触发防御反应，包括细胞死亡。GH12蛋白广泛分布在微生物类群中，研究表明许多GH12蛋白在烟草中可诱导细胞死亡[6]。虽然XEG1具有木葡聚糖酶和β葡聚糖酶的活性，然而XEG1的引起植物细胞坏死的活性并不依赖于这两个酶活性。此外XEG1诱导的植物细胞坏死依赖于BAK1。研究还发现XEG1在疫霉菌侵染大豆后的早期（30min）内表达量迅速升高，然后慢慢下降。然而XEG1诱导的防御反应可被多种大豆疫霉分泌的RXLR效应蛋白抑制。这项研究表明XEG1一方面有助于增强大豆疫霉菌的毒力，但也可被植物识别诱导免疫反应，这种抗病反应反过来又被疫霉菌的RXLR效应蛋白所抑制。因此，XEG1代表一个质外体效应蛋白，可通过植物的PAMP识别机制而被识别。目前对XEG1是如何被植物识别诱导免疫反应的机理尚不清楚，因此鉴定XEG1的模式识别受体对揭示植物与疫霉菌的互作具有重要意义。
本次研究就是通过基因沉默的方法，将细胞表面受体蛋白相关基因沉默，瞬时表达XEG1后观察植物的坏死反应，判断此次研究的10个受体蛋白是否参与XEG1诱导植物产生免疫反应。
在应用中发现，以TRV为载体的VIGS体系，在抑制转基因和内源基因的表达上，诱导基因沉默的效率和持久性都优于PVX 和TMV 载体，而且TRV比其他病毒的症状轻，对植株造成的伤害小，不会掩盖沉默表型[7]。迄今为止，TRV 病毒载体已在番茄（Solanum lycopersicum）[8]、烟草（Nicotina spp.）[9]、矮牵牛（Petunia hybrida）[10]、辣椒（Capsicum spp.）[11]、拟南芥[12]和棉花（Gossypium spp.）[13]等多种植物上被广泛应用。
农杆菌介导的瞬时表达系统已广泛用于非转基因植物的基因功能研究，它可以更为便捷更为快速地导入外源基因，而且转入基因在短时间内就可表达表达。它的另一个特点是可以在一个叶片组织中同时导入多个基因。由于上述优点，这一研究技术在功能基因组学和蛋白组学研究中发挥巨大的作用。本次实验中运用了农杆菌侵染的方法将细胞膜受体蛋白的基因沉默载体导入到烟草叶片中进行受体基因的沉默。此外，通过农杆菌侵染的方法在烟草叶片中瞬时表达XEG1，并观察XEG1诱导的细胞坏死。
实验方法：
沉默载体的构建
1.1沉默载体和引物的设计
在烟草中找到相应的受体基因序列，寻找每个基因特异的片段（300400 bp）设计引物构建成沉默载体。
1.2 聚合酶链式反应(PCR)
1.2.1体系的制备
因为核酸在溶液状态下容易被降解，所以在网上订购的引物是干粉状态，需要将引物用超纯水溶解成10 uM储存液。将刚送来的干粉进行编号，将干粉分成两份一份备用一份放入离心机中(离心机已配平)，12000 rpm离心2 min，将干粉状的引物甩至管底，防止加水过程中引物损失。缓缓打开离心后的引物管，加入相应的超纯水，每次加完水后需要更换枪头，防止污染，然后放在20℃保存。
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