番茄抗性基因sw5b所对应的无毒基因的研究
摘要：番茄抗性基因Sw-5b能够抗番茄斑萎病毒（TSWV）。而根据基因对基因假说，只有当携带无毒基因的病原与携带抗病基因的寄主互作时，两者才会表现不亲和，即发生过敏性坏死反应（HR），寄主才能表现出抗病。TSWV为RNA病毒，基因组属于负单链RNA(一ssRNA类型)，由三个片段组成，由大到小分别为L RNA，M RNA以及S RNA，分别编码不同功能的蛋白NSs,NSm,N蛋白以及Gn和Gc蛋白。本实验采用分子生物技术，通过构建载体，处理注射农杆菌，观察过敏性坏死反应等一系列操作，对番茄抗性基因所对应的确切的无毒基因进行了探索，从而最终确定NSm蛋白为无毒基因。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法3
1.1 材料3
1.2.1 实验材料3
1.2.1 试验仪器3
1.2 方法3
1.2.1 构建载体3
1.2.2 农杆菌转化5
1.2.3 处理注射5
1.2.4 DAB染色5
2 结果与分析5
2.1 Sw5b与NSm的HR反应6
2.2 DAB显色反应6
3.讨论7
致谢7
参考文献8
图16
图26
图37
表13
表23
番茄抗性基因Sw5b所对应的无毒基因的研究
引言
引言 番茄显性抗病基因Sw5是从被证明是最佳TSWV抗性遗传资源的秘鲁番茄材料中鉴定出来的[1]，之后它被Sergio H. Brommonschenkel等人运用图位克隆的方法从番茄中克隆得到[2]。它与之前在番茄品种中检测到的Sw1、Sw2、Sw3、Sw4等抗性基因不同，这些基因对TSWV有小种特异抗性，很快就会被克服[3]，而Sw5则对TSWV有广谱抗性[4]，对番茄育种有巨大帮助。Sw5 与 Mi（抗根结线虫基因）以及RPM1（抗假单胞菌基因）属于同一类抗性基因，都有CC（NBARC）LRR 结构，富含亮氨酸重复和一个高度保
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
守的核苷酸结合位点。Sw5有两个高度同源的抗性基因候选，分别是Sw5a和Sw5b，烟草的转化实验显示Sw5b是具有抗性功能的基因拷贝，能抗番茄斑萎病毒，据蛋白预测表明Sw5是细胞质蛋白。
番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）最开始是于1919年在澳洲的番茄植株上发现的，之后Brillelebank将这个病毒命名为了斑萎病（Spottedwilt）[5]。番茄斑萎病毒属于布尼亚病毒（Bnuyaviridae）科，是此科中唯一可以侵染植物的病毒属。由它引起的病害在全世界广泛流行，遍布各个地区和地区，包括热带、亚热带和温带，所侵入的国家有欧洲、北美、南美、亚洲和大洋州。其危害之大难以想象，能够侵害大多数农业和园艺作物，共侵染82科900多种单、双子叶植物，危害蔬菜、花卉及多种经济粮食作物如番茄、辣椒、马铃薯、花生、莴苣、豌豆、烟草、菊花、银莲花、百日草、大岩桐、大丽花及仙客来等。导致在全世界范围内都产生重大的农业经济损失。目前，斑萎病成为了全球十大农业病害之一，也因此在国际上深受重视。同时番茄斑萎病毒也是中国进境检疫的有害生物之一[6]。
番茄斑萎病毒是属于RNA病毒，病毒粒体为球状体，直径约为80110nm,它的基因组为三分体基因组，基因组属于负单链RNA（ssRNA类型），基因片段按从大到小来列举，分别为L RNA、M RNA和S RNA，其中ssRNAL为负义，ssRNAM和ssRNAS为双义。番茄斑萎病毒的L片段编码了一个大蛋白，经研究发现，这个蛋白可能是与RNA复制相关的RNA复制酶（RaRp）；M片段分为病毒链以及互补链，它的互补链RNA编码的是两个糖蛋白Gn和Gc，而病毒链RNA则编码非结构运动蛋白NSm；同样，S片段的互补链RNA编码外壳蛋白即核衣壳N蛋白[7]，病毒链RNA编码非结构蛋白NSs。目前的各项研究表明，NSm与病毒细胞间的运动有必然联系，同时能刺激原生质体中管状体的形成。NSs在寄主细胞中可形成拟结晶状或者是纤维状内含体，它的功能目前还在继续探究中。GN和Gc基因关系到病毒装配以及蓟马病毒传播机制[8]。
番茄斑萎病毒作为如此重要的病毒，它的传播途径也是研究学家一直在探索中的。目前，已经证实的可以传播番茄斑萎病毒的蓟马至少有九种，其中包括，最初西花蓟马，棉蚜蓟马，烟蓟马以及后来报道的花蓟马等等。然而在这之中充当最主要传播媒介的同时也是最早发现具有传毒本领的则是西花蓟马，导致作物的损失严重时可高达70%，甚至导致绝收[9]。番茄斑萎病毒的传播方式为循环增值型传播，这在植物病毒中是很少数的，因为这种方式意味着，传毒介体一旦携带了病毒，就会终身携带病毒，并且能在昆虫介体体内自行复制增值，从而提高了复制效率。通常拿西花蓟马传毒过程来举例说明病毒的传播途径。西花蓟马的一生可以分为卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段，但并不是所有阶段都能传毒，准确来说获毒只在若虫阶段，西花蓟马通过取食感染病毒的植株而获毒。病毒粒子通过植物组织汁液进入若虫口腔，随后到达中肠并且侵染，病毒的糖蛋白可以保护病毒穿过中肠围食膜，研究还发现，病毒外鞘膜糖蛋白在病毒侵染西花蓟马过程中必不可少，它能够与中肠上皮细胞膜的受体蛋白结合，到达上皮组织。然后若虫和成虫携带病毒转移取食就能够在寄主之间传播病毒。值得一提的是，获毒和传毒过程都不是立马完成的。有效获毒需要若虫在感病植株上取食长达1530分钟，而有效传毒也需要在虫体内复制增值72h以上。一般西花蓟马的毒力可保持2230d，但是它不会卵穿后代[10]。
不同种类的寄主被番茄斑萎病毒侵染后会表现出不同的症状。常见的症状为，叶片上呈现出黄色或者是褐色的环斑和线纹斑，有的可能会出现坏死斑，叶柄和茎秆上会出现褐色条纹，感病的植株通常会发生顶枯矮化现象，最终萎蔫导致死亡[11]。
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器设备
因本实验采用的是分子生物技术，因此材料与仪器的使用均与分子紧密相关，如PCR仪、移液枪、离心机等等。
1．1．1 实验材料
在实验操作过程中需要用到生物材料，如烟草、大肠杆菌、农杆菌等。同时，非生物材料也是不可或缺的，如PCR Buffer,dNTP,酶，酒精等。生物与非生物实验材料如表1。
表1 实验材料一览表
实验材料
细菌来源/PCR反应体系
植物来源/电泳
病毒来源/提质粒相关试剂
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法3
1.1 材料3
1.2.1 实验材料3
1.2.1 试验仪器3
1.2 方法3
1.2.1 构建载体3
1.2.2 农杆菌转化5
1.2.3 处理注射5
1.2.4 DAB染色5
2 结果与分析5
2.1 Sw5b与NSm的HR反应6
2.2 DAB显色反应6
3.讨论7
致谢7
参考文献8
图16
图26
图37
表13
表23
番茄抗性基因Sw5b所对应的无毒基因的研究
引言
引言 番茄显性抗病基因Sw5是从被证明是最佳TSWV抗性遗传资源的秘鲁番茄材料中鉴定出来的[1]，之后它被Sergio H. Brommonschenkel等人运用图位克隆的方法从番茄中克隆得到[2]。它与之前在番茄品种中检测到的Sw1、Sw2、Sw3、Sw4等抗性基因不同，这些基因对TSWV有小种特异抗性，很快就会被克服[3]，而Sw5则对TSWV有广谱抗性[4]，对番茄育种有巨大帮助。Sw5 与 Mi（抗根结线虫基因）以及RPM1（抗假单胞菌基因）属于同一类抗性基因，都有CC（NBARC）LRR 结构，富含亮氨酸重复和一个高度保
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
守的核苷酸结合位点。Sw5有两个高度同源的抗性基因候选，分别是Sw5a和Sw5b，烟草的转化实验显示Sw5b是具有抗性功能的基因拷贝，能抗番茄斑萎病毒，据蛋白预测表明Sw5是细胞质蛋白。
番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）最开始是于1919年在澳洲的番茄植株上发现的，之后Brillelebank将这个病毒命名为了斑萎病（Spottedwilt）[5]。番茄斑萎病毒属于布尼亚病毒（Bnuyaviridae）科，是此科中唯一可以侵染植物的病毒属。由它引起的病害在全世界广泛流行，遍布各个地区和地区，包括热带、亚热带和温带，所侵入的国家有欧洲、北美、南美、亚洲和大洋州。其危害之大难以想象，能够侵害大多数农业和园艺作物，共侵染82科900多种单、双子叶植物，危害蔬菜、花卉及多种经济粮食作物如番茄、辣椒、马铃薯、花生、莴苣、豌豆、烟草、菊花、银莲花、百日草、大岩桐、大丽花及仙客来等。导致在全世界范围内都产生重大的农业经济损失。目前，斑萎病成为了全球十大农业病害之一，也因此在国际上深受重视。同时番茄斑萎病毒也是中国进境检疫的有害生物之一[6]。
番茄斑萎病毒是属于RNA病毒，病毒粒体为球状体，直径约为80110nm,它的基因组为三分体基因组，基因组属于负单链RNA（ssRNA类型），基因片段按从大到小来列举，分别为L RNA、M RNA和S RNA，其中ssRNAL为负义，ssRNAM和ssRNAS为双义。番茄斑萎病毒的L片段编码了一个大蛋白，经研究发现，这个蛋白可能是与RNA复制相关的RNA复制酶（RaRp）；M片段分为病毒链以及互补链，它的互补链RNA编码的是两个糖蛋白Gn和Gc，而病毒链RNA则编码非结构运动蛋白NSm；同样，S片段的互补链RNA编码外壳蛋白即核衣壳N蛋白[7]，病毒链RNA编码非结构蛋白NSs。目前的各项研究表明，NSm与病毒细胞间的运动有必然联系，同时能刺激原生质体中管状体的形成。NSs在寄主细胞中可形成拟结晶状或者是纤维状内含体，它的功能目前还在继续探究中。GN和Gc基因关系到病毒装配以及蓟马病毒传播机制[8]。
番茄斑萎病毒作为如此重要的病毒，它的传播途径也是研究学家一直在探索中的。目前，已经证实的可以传播番茄斑萎病毒的蓟马至少有九种，其中包括，最初西花蓟马，棉蚜蓟马，烟蓟马以及后来报道的花蓟马等等。然而在这之中充当最主要传播媒介的同时也是最早发现具有传毒本领的则是西花蓟马，导致作物的损失严重时可高达70%，甚至导致绝收[9]。番茄斑萎病毒的传播方式为循环增值型传播，这在植物病毒中是很少数的，因为这种方式意味着，传毒介体一旦携带了病毒，就会终身携带病毒，并且能在昆虫介体体内自行复制增值，从而提高了复制效率。通常拿西花蓟马传毒过程来举例说明病毒的传播途径。西花蓟马的一生可以分为卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段，但并不是所有阶段都能传毒，准确来说获毒只在若虫阶段，西花蓟马通过取食感染病毒的植株而获毒。病毒粒子通过植物组织汁液进入若虫口腔，随后到达中肠并且侵染，病毒的糖蛋白可以保护病毒穿过中肠围食膜，研究还发现，病毒外鞘膜糖蛋白在病毒侵染西花蓟马过程中必不可少，它能够与中肠上皮细胞膜的受体蛋白结合，到达上皮组织。然后若虫和成虫携带病毒转移取食就能够在寄主之间传播病毒。值得一提的是，获毒和传毒过程都不是立马完成的。有效获毒需要若虫在感病植株上取食长达1530分钟，而有效传毒也需要在虫体内复制增值72h以上。一般西花蓟马的毒力可保持2230d，但是它不会卵穿后代[10]。
不同种类的寄主被番茄斑萎病毒侵染后会表现出不同的症状。常见的症状为，叶片上呈现出黄色或者是褐色的环斑和线纹斑，有的可能会出现坏死斑，叶柄和茎秆上会出现褐色条纹，感病的植株通常会发生顶枯矮化现象，最终萎蔫导致死亡[11]。
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器设备
因本实验采用的是分子生物技术，因此材料与仪器的使用均与分子紧密相关，如PCR仪、移液枪、离心机等等。
1．1．1 实验材料
在实验操作过程中需要用到生物材料，如烟草、大肠杆菌、农杆菌等。同时，非生物材料也是不可或缺的，如PCR Buffer,dNTP,酶，酒精等。生物与非生物实验材料如表1。
表1 实验材料一览表
实验材料
细菌来源/PCR反应体系
植物来源/电泳
病毒来源/提质粒相关试剂
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