取食dsldα1对马铃薯甲虫ldα1及其他nachr基因表达量的影响
摘要：马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata (Say))是马铃薯的重要食叶害虫，是我国重要的外来入侵物种，广泛分布于我国新疆马铃薯种植区。目前防治该虫的主要药剂包括新烟碱类药，其作用靶标为烟碱型乙酰胆碱受体基因(nAChRs)。RNA干扰(RNAi)是近年来蓬勃兴起的一项基因沉默技术，可用于基因功能的研究。前期工作利用马铃薯甲虫烟碱型乙酰胆碱受体基因Ldα1的dsLdα1菌液喂食了马铃薯甲虫成虫和幼虫，本课题以这些处理试虫为研究对象，通过实时荧光定量PCR技术测定试虫靶标基因Ldα1及其他非靶标基因表达量的变化。结果发现成虫和幼虫的Ldα1表达量明显下降，表明利用dsRNA喂食法可以沉默对马铃薯甲虫乙酰胆碱受体基因；另外还发现幼虫中Ldα3、Ldα9和Ld(1的表达量明显上升，可能为了维持nAChR正常功能，这三个基因作为Ldα1基因表达量损失的补偿。研究结果可以为马铃薯甲虫 nAChR 亚基功能以及对新烟碱类药剂靶标作用机制的研究提供重要基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1供试昆虫 3
1.1.2主要试剂和仪器设备 3
1.2 总RNA的提取 3
1.3 cDNA第一条链的合成 4
1.4 定量引物设计 4
1.5 实时荧光定量PCR 5
1.6 数据统计方法 5
2 结果与分析 5
2.1 实时定量PCR产物溶解曲线分析 5
2.2喂食dsLdα1菌液后靶标基因及非靶标基因的相对表达量分析 6
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 10
表1 基因荧光定量PCR使用引物序列（qPCR引物） 4
图1 马铃薯甲虫nAChRα1基因实时荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线图 6
图2 喂食Ldα1 dsRNA菌液后Ldα1基因相对表达量图 7
图3 喂食Ldα1 dsRNA菌液后马铃薯甲虫成
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
虫非目标基因的相对表量图7
图4 喂食Ldα1 dsRNA菌液后马铃薯甲虫成虫非目标基因的相对表量图8
取食dsLdα1对马铃薯甲虫 Ldα1及其他
nAChR基因表达量的影响
引言
马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata(Say))，Colorado potato beetle）属鞘翅目，叶甲科，是一种极具毁灭性的外来有害生物。1857 年，该虫严重危害马铃薯，随后迅速扩散，分布于北美几乎所有马铃薯种植区，包括美国、加拿大南部、墨西哥和危地马拉北部。从 1876 年起，马铃薯甲虫开始出现在欧洲大陆，之后有继续向东扩散的趋势[1]。1993 年，马铃薯甲虫自哈萨克斯坦入侵中国新疆北部地区，并逐年向东扩散。2003 年到达其目前分布的最前沿——木垒县，至今被成功阻截在该县大石头乡以西。但其进一步向东扩散进入中国马铃薯主产区甘肃、内蒙古等省份的风险仍在加剧[2]。目前已经侵入到了我国东北[3]。在美洲及欧洲的马铃薯甲虫每年可发生1～3代，在我国新疆马铃薯甲虫发生区其1年可发生1～3代，多以2代为主。马铃薯甲虫以成虫越冬，其越冬场所多为寄主田的土壤里，尤其是马铃薯、茄子等，也会有少数成虫在寄主田相邻的田块越冬。由于马铃薯甲虫的持续扩散能力、定殖和种群建立能力均很强，凡是茄科植物都有可能遭到该虫危害, 其中马铃薯是最适寄主[4]。成、幼虫危害马铃薯叶片和嫩尖, 甚至可以将叶片全部吃光,一般情况下造成减产30%~50% , 发生严重的地区减产达90%[5]在干燥的气候环境下，马铃薯甲虫亦会暴食蔬菜叶片，严重发生时可在 两到三天将将蔬菜叶片吃尽而造成蔬菜严重减产。此外，马铃薯甲虫还可取食瓜类和水果的表面，使得受害部位受损，对瓜果的质量和产量造成影响，对各国农业经济也造成重大危害[6]。
对于马铃薯甲虫的研究不仅涉及其分布、危害以及其主要生物学特征，对于其防治及抗药性的研究也开展多年。我国对马铃薯甲虫的防治主要有农业与物理防治，生物防治和化学防治，其中化学防治较为普遍。加强田间管理，秋翻冬灌，轮作倒茬，人工捕杀或集中诱杀，适期晚播都是较好的农业及物理防治措施。而关于生物防治，近些年有利用捕食性天敌和寄生性天敌进行保护，如十二星瓢虫、寡节小蜂，同时也有微生物杀虫剂和植物源性杀虫剂的开发和利用。最为普遍的化学防治，在防治马铃薯甲虫中具有重要作用。化学防治主要防治1、2代幼虫，国内多为采用有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类杀虫剂防治。而随着化学防治的推进，马铃薯甲虫的抗药性也有快速的发展。目前，马铃薯甲虫几乎对所有已注册的化学农药均表现出一定的抗性[78]。其中包括对新烟碱类杀虫剂，如吡虫啉，噻虫嗪，啶虫脒也产生了抗性[6, 9]。新烟碱类杀虫剂作为激动剂作用于烟碱型乙酰胆碱受体。在与乙酰胆碱受体结合后，可以选择性的控制昆虫神经系统中的乙酰胆碱酯酶，通过将昆虫正常的中枢神经系统中断，以使昆虫出现麻痹至死亡[10]。
烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)属于神经递质门控离子通道蛋白，目前有关马铃薯甲虫nAChR亚基组成及分子结构的研究甚少，已知的nAChR基因有α1、α2、α4、α7、α8和α9等亚基基因[11]。新烟碱类药剂对昆虫的防治具有高效性，因其与有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类不存在靶标交互抗性，所以其具有较好的应用前景。
RNA干扰是研究基因功能的重要工具之一，因其具有普遍性、高效性和高度特异性，所以在昆虫的发育、生殖及行为等的研究中得到了广泛应用。其利用外源性或内源性的双链RNA(dsDNA)导入细胞后可触发同源基因mRNA的特异性降解，使得该基因表达不表达。这种防御机制可以参与调控基因表达，是在真核生物在长期进化的过程中形成的，同时也可调控真核生物以抵御病毒侵染[12]。RNA干扰最为广泛的应用是通过使某基因的表达水平下降或沉默来了解该基因的功能。在昆虫的研究中，有多种方法可导入外源基因，通过注射[13]、浸泡[14]、喂食[15]、转基因[16]和病毒介导等方法，将dsNRA导入，即可成功抑制对应的靶标基因。由于饲喂法较为简单易行，其在鞘翅目、鳞翅目和半翅目昆虫中都已有了成功应用[17]。
本文利用实时荧光定量PCR[1819]，分析马铃薯甲虫靶标烟碱型乙酰胆碱受体y基因Ldα1干扰后基因表达量的差异，评估利用dsRNA喂食法对马铃薯甲虫nAChR目标基因的干扰效率及对非靶标基因表达量的影响，研究结果可对有效利用RNA干扰技术研究马铃薯甲虫靶标nAChR亚基的功能以及探讨新烟碱类药剂的作用机理具有重要意义。
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1供试昆虫 3
1.1.2主要试剂和仪器设备 3
1.2 总RNA的提取 3
1.3 cDNA第一条链的合成 4
1.4 定量引物设计 4
1.5 实时荧光定量PCR 5
1.6 数据统计方法 5
2 结果与分析 5
2.1 实时定量PCR产物溶解曲线分析 5
2.2喂食dsLdα1菌液后靶标基因及非靶标基因的相对表达量分析 6
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 10
表1 基因荧光定量PCR使用引物序列（qPCR引物） 4
图1 马铃薯甲虫nAChRα1基因实时荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线图 6
图2 喂食Ldα1 dsRNA菌液后Ldα1基因相对表达量图 7
图3 喂食Ldα1 dsRNA菌液后马铃薯甲虫成
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
虫非目标基因的相对表量图7
图4 喂食Ldα1 dsRNA菌液后马铃薯甲虫成虫非目标基因的相对表量图8
取食dsLdα1对马铃薯甲虫 Ldα1及其他
nAChR基因表达量的影响
引言
马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata(Say))，Colorado potato beetle）属鞘翅目，叶甲科，是一种极具毁灭性的外来有害生物。1857 年，该虫严重危害马铃薯，随后迅速扩散，分布于北美几乎所有马铃薯种植区，包括美国、加拿大南部、墨西哥和危地马拉北部。从 1876 年起，马铃薯甲虫开始出现在欧洲大陆，之后有继续向东扩散的趋势[1]。1993 年，马铃薯甲虫自哈萨克斯坦入侵中国新疆北部地区，并逐年向东扩散。2003 年到达其目前分布的最前沿——木垒县，至今被成功阻截在该县大石头乡以西。但其进一步向东扩散进入中国马铃薯主产区甘肃、内蒙古等省份的风险仍在加剧[2]。目前已经侵入到了我国东北[3]。在美洲及欧洲的马铃薯甲虫每年可发生1～3代，在我国新疆马铃薯甲虫发生区其1年可发生1～3代，多以2代为主。马铃薯甲虫以成虫越冬，其越冬场所多为寄主田的土壤里，尤其是马铃薯、茄子等，也会有少数成虫在寄主田相邻的田块越冬。由于马铃薯甲虫的持续扩散能力、定殖和种群建立能力均很强，凡是茄科植物都有可能遭到该虫危害, 其中马铃薯是最适寄主[4]。成、幼虫危害马铃薯叶片和嫩尖, 甚至可以将叶片全部吃光,一般情况下造成减产30%~50% , 发生严重的地区减产达90%[5]在干燥的气候环境下，马铃薯甲虫亦会暴食蔬菜叶片，严重发生时可在 两到三天将将蔬菜叶片吃尽而造成蔬菜严重减产。此外，马铃薯甲虫还可取食瓜类和水果的表面，使得受害部位受损，对瓜果的质量和产量造成影响，对各国农业经济也造成重大危害[6]。
对于马铃薯甲虫的研究不仅涉及其分布、危害以及其主要生物学特征，对于其防治及抗药性的研究也开展多年。我国对马铃薯甲虫的防治主要有农业与物理防治，生物防治和化学防治，其中化学防治较为普遍。加强田间管理，秋翻冬灌，轮作倒茬，人工捕杀或集中诱杀，适期晚播都是较好的农业及物理防治措施。而关于生物防治，近些年有利用捕食性天敌和寄生性天敌进行保护，如十二星瓢虫、寡节小蜂，同时也有微生物杀虫剂和植物源性杀虫剂的开发和利用。最为普遍的化学防治，在防治马铃薯甲虫中具有重要作用。化学防治主要防治1、2代幼虫，国内多为采用有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类杀虫剂防治。而随着化学防治的推进，马铃薯甲虫的抗药性也有快速的发展。目前，马铃薯甲虫几乎对所有已注册的化学农药均表现出一定的抗性[78]。其中包括对新烟碱类杀虫剂，如吡虫啉，噻虫嗪，啶虫脒也产生了抗性[6, 9]。新烟碱类杀虫剂作为激动剂作用于烟碱型乙酰胆碱受体。在与乙酰胆碱受体结合后，可以选择性的控制昆虫神经系统中的乙酰胆碱酯酶，通过将昆虫正常的中枢神经系统中断，以使昆虫出现麻痹至死亡[10]。
烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)属于神经递质门控离子通道蛋白，目前有关马铃薯甲虫nAChR亚基组成及分子结构的研究甚少，已知的nAChR基因有α1、α2、α4、α7、α8和α9等亚基基因[11]。新烟碱类药剂对昆虫的防治具有高效性，因其与有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类不存在靶标交互抗性，所以其具有较好的应用前景。
RNA干扰是研究基因功能的重要工具之一，因其具有普遍性、高效性和高度特异性，所以在昆虫的发育、生殖及行为等的研究中得到了广泛应用。其利用外源性或内源性的双链RNA(dsDNA)导入细胞后可触发同源基因mRNA的特异性降解，使得该基因表达不表达。这种防御机制可以参与调控基因表达，是在真核生物在长期进化的过程中形成的，同时也可调控真核生物以抵御病毒侵染[12]。RNA干扰最为广泛的应用是通过使某基因的表达水平下降或沉默来了解该基因的功能。在昆虫的研究中，有多种方法可导入外源基因，通过注射[13]、浸泡[14]、喂食[15]、转基因[16]和病毒介导等方法，将dsNRA导入，即可成功抑制对应的靶标基因。由于饲喂法较为简单易行，其在鞘翅目、鳞翅目和半翅目昆虫中都已有了成功应用[17]。
本文利用实时荧光定量PCR[1819]，分析马铃薯甲虫靶标烟碱型乙酰胆碱受体y基因Ldα1干扰后基因表达量的差异，评估利用dsRNA喂食法对马铃薯甲虫nAChR目标基因的干扰效率及对非靶标基因表达量的影响，研究结果可对有效利用RNA干扰技术研究马铃薯甲虫靶标nAChR亚基的功能以及探讨新烟碱类药剂的作用机理具有重要意义。
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