灰飞虱传播水稻条纹病毒（rsv）机理的初步研究
灰飞虱是传播水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）的主要昆虫介体，RSV引起的水稻条纹叶枯病曾多次在我国水稻种植区暴发流行，给水稻生产造成了严重的经济损失。为了研究灰飞虱传毒的条件，本实验设计了两种灰飞虱取食方法，一是带毒灰飞虱直接取食水稻苗；二是灰飞虱通过刺膜法取食水稻研磨液。结果显示，当灰飞虱取食水稻苗1 h后，即可将RSV接种至水稻，当灰飞虱刺膜取食水稻汁液，可以正常存活，但并没有接种病毒。为进一步分析灰飞虱唾液腺释放RSV的条件，本实验采用昆虫行为电图（EPG）技术分析了灰飞虱直接取食水稻苗和刺膜取食水稻汁液时的口针行为差异。结果显示两种取食方法途径的最大差异为刺膜取食时，灰飞虱口针未出现韧皮部取食波（N4a和N4b）。由于灰飞虱刺膜取食水稻汁液时，唾液腺未释放病毒，这说明灰飞虱的口针接触到韧皮部取食对于唾液腺释放RSV至关重要。本实验确定了口针刺吸韧皮部是灰飞虱唾液腺释放RSV的前提条件，为灰飞虱传毒机制的进一步研究以及今后控制灰飞虱传播病毒奠定了基础。关键字 水稻条纹病毒，灰飞虱，传毒条件，韧皮部取食，EPG技术
目 录
1 引言 1
1.1 水稻条纹病毒的研究状况 1
1.1.1 水稻条纹病毒的寄主范围和症状 1
1.1.2 水稻条纹病毒的传播介体—灰飞虱 2
1.2 植物病毒介体昆虫传播机制 2
1.3 研究目的和意义 3
2 材料和方法 3
2.1 实验材料 3
2.1.1 供试植株和昆虫 3
2.1.2 主要试剂 3
2.1.3 所需仪器 4
2.1.4 引物设计 4
2.1.5 其他的实验材料 4
2.2 实验方法 4
2.2.1 研究内容 4
2.2.2 实验设计 4
2.2.3 灰飞虱带毒率测定 5
2.2.4 灰飞虱接毒 5
2.2.5 RNA提取 7
2.2.6 反转录cDNA 7
2.2.7 PCR检测 8
2.2.8 琼脂糖核酸凝胶电泳 9
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2.2.9 昆虫行为电图（EPG） 9
3 结果与分析 9
3.1 灰飞虱带毒率测定结果 9
3.2 灰飞虱接毒实验 10
3.3 昆虫行为电图（EPG） 10
结 论 13
致谢 14
参考文献 15
1 引言
水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）引发的水稻条纹叶枯病[1]是目前我国水稻的一种重要的病害，俗称水稻上的“癌症”。水稻条纹叶枯病最早在日本发现，随后在其他国家也发现了该病，例如中国、苏联，韩国等[2]。我国最早是在1963年江苏南部地区多次发生[3]，因该病具有快速蔓延的特性，随后的几十年间，我国众多水稻种植区域都大量爆发水稻条纹叶枯病，目前为止该病已经蔓延到了全国18个省市[4]。该病一经大面积发生，都会造成严重的损失，普通发病田块产量的损失达20%30%,严重田块产量的损失70%80%，有的甚至颗粒无收。在众多水稻种植区域中以江苏地区发病最为严重，据统计，在20042005两年间江苏每年发病面积达到170hm2,部分田块出现绝收的现象[5]。
RSV主要是通过介体灰飞虱传播的[6]，灰飞虱通过刺吸式口器吸食带毒水稻植株，获毒之后在体内以循回增殖的方式传播RSV[7]。目前关于病毒RSV的传毒机理研究较少。通过了解关于RSV与灰飞虱互作的主要研究内容，发现目前普遍认为RSV进入灰飞虱体内时有如下的步骤：RSV要先跨过中肠屏障再进入灰飞虱的细胞内。进一步病毒如何跨过基底膜到达血淋巴系统，传播到昆虫身体的其他部位，最后进入唾液腺中，在通过昆虫刺吸来传毒[8]。本论文以健康水稻苗及水稻研磨液为材料，分别饲喂带毒灰飞虱，通过设置两种不同的饲养方式和不同时间点，以及采用昆虫行为电图（EPG）技术，来研究灰飞虱唾液腺释放RSV的条件。
1.1 水稻条纹病毒研究状况
1.1.1 水稻条纹病毒的寄主范围和症状
水稻条纹病毒是纤细病毒属（Tenuivirus）,主要由灰飞虱传播，并且可经卵传播[9]，可侵染水稻、大麦、小麦、稗草、玉米、看麦娘等80多种植物[10~12]：禾本科作物和杂草。由此可见RSV在田间的寄主范围是很广泛的，但除了水稻外，其它寄主在侵染循环中作用不大。水稻条纹病毒侵染水稻后，主要的外部症状：褪绿的条纹斑点或者斑块。一般较幼嫩的心叶会最早出现这种症状。但由于水稻的品种、接种方法、传播介体的龄期和环境等不同因素的相互作用，都会使实际显示出的病害症状有较多的可变性，但大致分为两种病害症状（图1）：一种是“卷叶型”，表现为弧圈状下垂，心叶褪绿并捻转，，该症状为典型的“假枯心”，严重时心叶会枯死。另外一种是“展叶型”，表现为病株的叶片不下垂捻转，心叶顺着叶脉表现为断续的黄白和黄绿色条斑[13~15]。
1.1.2 水稻条纹病毒的传播介体—灰飞虱
该病毒的传毒介体只能是昆虫，病株的汁液等其他途径都不能传毒。RSV的昆虫介体有灰飞虱、白背飞虱、背条飞虱等，而灰飞虱是作为主要的传毒介体,包括若虫和成虫。区别则是在灰飞虱的整个生长发育过程中，35龄若虫期的传毒能力是相对较强的，而变成成虫后的传毒能力是会有所下降的[16]。灰飞虱是属于循回型植物病毒介体昆虫，因而也是以循环增殖的方式来传毒的。一经获毒便可经卵持久性传毒[17]，但传毒能力是在传毒之后，逐渐减弱的[18]。
1.2 植物病毒介体昆虫传播机制
植物病毒大多是依赖介体昆虫传播而造成大面积的流行危害，进而造成作物严重的经济损失。据调察，昆虫传播的植物病毒每年造成作物的损失达几十亿美元[19]因而要想切断介体昆虫的传播，控制住植物病毒所引发的的病害，就必须了解昆虫传毒的机理。近年来生物学的快速发展，使得人们对植物病毒昆虫介体传播机制的研究有很大进展。根据介体从患病植株获毒的时间病毒、在介体中的位置以及介体传毒的时间等参数，将植物病毒的传播方式分为非循回型和循回型两种方式[19、20]：
目 录
1 引言 1
1.1 水稻条纹病毒的研究状况 1
1.1.1 水稻条纹病毒的寄主范围和症状 1
1.1.2 水稻条纹病毒的传播介体—灰飞虱 2
1.2 植物病毒介体昆虫传播机制 2
1.3 研究目的和意义 3
2 材料和方法 3
2.1 实验材料 3
2.1.1 供试植株和昆虫 3
2.1.2 主要试剂 3
2.1.3 所需仪器 4
2.1.4 引物设计 4
2.1.5 其他的实验材料 4
2.2 实验方法 4
2.2.1 研究内容 4
2.2.2 实验设计 4
2.2.3 灰飞虱带毒率测定 5
2.2.4 灰飞虱接毒 5
2.2.5 RNA提取 7
2.2.6 反转录cDNA 7
2.2.7 PCR检测 8
2.2.8 琼脂糖核酸凝胶电泳 9
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2.2.9 昆虫行为电图（EPG） 9
3 结果与分析 9
3.1 灰飞虱带毒率测定结果 9
3.2 灰飞虱接毒实验 10
3.3 昆虫行为电图（EPG） 10
结 论 13
致谢 14
参考文献 15
1 引言
水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）引发的水稻条纹叶枯病[1]是目前我国水稻的一种重要的病害，俗称水稻上的“癌症”。水稻条纹叶枯病最早在日本发现，随后在其他国家也发现了该病，例如中国、苏联，韩国等[2]。我国最早是在1963年江苏南部地区多次发生[3]，因该病具有快速蔓延的特性，随后的几十年间，我国众多水稻种植区域都大量爆发水稻条纹叶枯病，目前为止该病已经蔓延到了全国18个省市[4]。该病一经大面积发生，都会造成严重的损失，普通发病田块产量的损失达20%30%,严重田块产量的损失70%80%，有的甚至颗粒无收。在众多水稻种植区域中以江苏地区发病最为严重，据统计，在20042005两年间江苏每年发病面积达到170hm2,部分田块出现绝收的现象[5]。
RSV主要是通过介体灰飞虱传播的[6]，灰飞虱通过刺吸式口器吸食带毒水稻植株，获毒之后在体内以循回增殖的方式传播RSV[7]。目前关于病毒RSV的传毒机理研究较少。通过了解关于RSV与灰飞虱互作的主要研究内容，发现目前普遍认为RSV进入灰飞虱体内时有如下的步骤：RSV要先跨过中肠屏障再进入灰飞虱的细胞内。进一步病毒如何跨过基底膜到达血淋巴系统，传播到昆虫身体的其他部位，最后进入唾液腺中，在通过昆虫刺吸来传毒[8]。本论文以健康水稻苗及水稻研磨液为材料，分别饲喂带毒灰飞虱，通过设置两种不同的饲养方式和不同时间点，以及采用昆虫行为电图（EPG）技术，来研究灰飞虱唾液腺释放RSV的条件。
1.1 水稻条纹病毒研究状况
1.1.1 水稻条纹病毒的寄主范围和症状
水稻条纹病毒是纤细病毒属（Tenuivirus）,主要由灰飞虱传播，并且可经卵传播[9]，可侵染水稻、大麦、小麦、稗草、玉米、看麦娘等80多种植物[10~12]：禾本科作物和杂草。由此可见RSV在田间的寄主范围是很广泛的，但除了水稻外，其它寄主在侵染循环中作用不大。水稻条纹病毒侵染水稻后，主要的外部症状：褪绿的条纹斑点或者斑块。一般较幼嫩的心叶会最早出现这种症状。但由于水稻的品种、接种方法、传播介体的龄期和环境等不同因素的相互作用，都会使实际显示出的病害症状有较多的可变性，但大致分为两种病害症状（图1）：一种是“卷叶型”，表现为弧圈状下垂，心叶褪绿并捻转，，该症状为典型的“假枯心”，严重时心叶会枯死。另外一种是“展叶型”，表现为病株的叶片不下垂捻转，心叶顺着叶脉表现为断续的黄白和黄绿色条斑[13~15]。
1.1.2 水稻条纹病毒的传播介体—灰飞虱
该病毒的传毒介体只能是昆虫，病株的汁液等其他途径都不能传毒。RSV的昆虫介体有灰飞虱、白背飞虱、背条飞虱等，而灰飞虱是作为主要的传毒介体,包括若虫和成虫。区别则是在灰飞虱的整个生长发育过程中，35龄若虫期的传毒能力是相对较强的，而变成成虫后的传毒能力是会有所下降的[16]。灰飞虱是属于循回型植物病毒介体昆虫，因而也是以循环增殖的方式来传毒的。一经获毒便可经卵持久性传毒[17]，但传毒能力是在传毒之后，逐渐减弱的[18]。
1.2 植物病毒介体昆虫传播机制
植物病毒大多是依赖介体昆虫传播而造成大面积的流行危害，进而造成作物严重的经济损失。据调察，昆虫传播的植物病毒每年造成作物的损失达几十亿美元[19]因而要想切断介体昆虫的传播，控制住植物病毒所引发的的病害，就必须了解昆虫传毒的机理。近年来生物学的快速发展，使得人们对植物病毒昆虫介体传播机制的研究有很大进展。根据介体从患病植株获毒的时间病毒、在介体中的位置以及介体传毒的时间等参数，将植物病毒的传播方式分为非循回型和循回型两种方式[19、20]：
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