褐飞虱类胰岛素多肽对生殖的调控研究
褐飞虱[Nilaparvata lugens]是亚洲稻区水稻上的主要害虫，它通过直接吮吸水稻韧皮部汁液和传播植物病毒危害水稻，可远距离迁飞为害，且一旦条件适宜，极易爆发成灾，对水稻产量造成重大损失。类胰岛素多肽（Insulin-like peptides，ILPs）是生物体多组织分泌的一类内分泌多肽，它具有调控生长、发育、代谢以及繁殖等一系列功能。本论文主要针对褐飞虱的4个ILPs（ILP1-4）开展研究，取得以下主要结果(1) 利用 RNA interference (RNAi)技术，发现沉默NlIlpl、NlIlp2、NlIlp4这三个基因对产卵量无显著影响，但沉默NlIlp3显著降低5天和10天的产卵量；（2）通过RNAi干扰实验，发现沉默NlIlp3显著降低卵黄原蛋白基因vitellogenin的表达量。本研究结果不但丰富了昆虫类胰岛素多肽的生物学功能，而且也将为褐飞虱的防治提供新靶标与新思路。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 4
1.2.1基本实验4
1.2.2实验方法6
2结果与分析7
2.1 RNAi干扰褐飞虱类胰岛素多肽基因对5天产卵量的影响7
2.2 RNAi干扰褐飞虱类胰岛素多肽基因对10天产卵量的影响8
2.3 RNAi干扰类胰岛素多肽对卵黄原蛋白表达的影响 9
3讨论9
总结10
创新10
致谢10
参考文献11
褐飞虱类胰岛素多肽对生殖的调控研究
引言
引言
褐飞虱为单食性昆虫，仅以野生稻和栽培水稻作为寄主（朱绍先等，1984）。它对水稻的危害主要通过以下三种形式：产卵危害，直接刺吸危害以及传播水稻病毒危害：以若虫、成虫群聚于水稻基部刺吸茎叶组织的汁液，刺吸时分泌的凝固性唾液会形成口针鞘，阻碍稻株体内养分以及水份疏导。虫量多、受害严重时会使稻株基部变黑，水稻倒伏瘫痪，俗称“虱烧”、“冒尖”或者“透天”。其取食产卵时，会产生大量伤 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
口，破坏输导组织，促使稻株水分流失，加速水稻枯萎，且有利于小球菌核病、水稻纹枯病的侵染危害，其排泄的“蜜露”，富含各种氨基酸与糖类，极易滋生霉菌(芮明方等, 2011)，此外褐飞虱还能传播齿叶矮缩病毒（RRSV）和水稻草状丛矮缩病毒（RGSV）(程家安, 1996)。
褐飞虱分布于东南亚、南亚、太平洋岛屿及日本、朝鲜和澳大利亚等地(洪乃桥等，2007)。而20世纪60年代，褐飞虱只在亚洲一部分国家爆发成灾（高希武等，2006），70年代以后，由于我国水稻品种更替，耕作技术改变，伴随着杂交水稻的大面积推广，褐飞虱逐步在全国范围内爆发。进入本世纪后，褐飞虱发生的数量以及危害程度更是逐年攀升，时有爆发，严重危害我国水稻的产量。
对于褐飞虱的防治，传统的手段有1、农业防治：加强田间肥水管理、改善栽培制度、培育抗性水稻品种等，绿色环保；2、生物防治：包括微生物防治、天敌防治以及利用植物多样性，但微生物防治受环境影响较大，而人工释放天敌成本较高；3、物理防治：一般采用频振式杀虫灯，利用趋光或者趋化性进行防治（秦小娃等，2011）；4、化学防治：指用农药控制害虫，快速高效，是目前最主要、最普遍的防治手段。但因为长期单一大面积的应用，褐飞虱对农药产生了严重的抗药性；据统计，褐飞虱对吡虫啉、氟虫腈、噻嗪酮、吡蚜酮抗药性发展为中等至高等抗性(李建群等, 2014; 刘成社等, 2011; 施德等, 2008)。因此现阶段的研究热点集中在绿色、环保、高效、可持续发展的新方向。
胰岛素：由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。经过近几十年的探索研究，胰岛素大家族现已十分壮大。其中包含了胰岛素（insulin）、松弛肽（relaxins）、类胰岛素生长因子（insulinlike growth factors，IGFs）、家蚕素（bombyxin）以及一些类胰岛素多肽（insulinlike peptides，ILPs）(Koman et al., 1996; Claeys et al., 2002)。
我们把昆虫中的胰岛素相似蛋白称为类胰岛素多肽，其信号通路作用多样化，同时也极为保守，研究成果最早在果蝇中揭示：以PI3K途径为主，有效调节细胞的增殖、生长和衰老等过程。这条通路包括IRs （Chico），PTEN （dPTEN），PI3K （Dp110Dp60），Akt/PKB （dAkt/dPKB），类胰岛素肽dILPs作用于dInR后，dInR直接或者通过Chico来激活PI3K/Akt信号通路，而dPTEN作用于PI3K，抑制PI3K/Akt信号通路，其活化的dAKT能磷酸化大量的蛋白质如：dTSC（Tuberous sclerosis complex）、shaggy/GSK3、dFOXO，这其中dFOXO是dAKT十分关键的靶标因子，dFOXO直接调控果蝇的356个基因，对胰岛素信号通路也具有反馈调节作用(Alic et al., 2011; Finch et al., 2001;Potter et al., 2001)。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，是指在细胞中导入内源或外源的和靶标基因mRNA编码区同源的RNA双链时，该mRNA会发生降解从而导致基因表达沉默的现象，此现象发生在转录后水平，所以也称作是转录后基因沉默。基于RNA interference (RNAi)技术对于害虫防治为一种全新的防治策略，本技术多用于基因组功能的研究，可为农业害虫防治提供靶标，且可利用转基因植物所介导的RNAi的成功，为农业害虫防治提供新途径，随着基因组以及转录组测序等生物技术的快速发展，筛选出能够通过RNAi干扰来防治害虫的靶标已成为可能(Li et al., 2013; Wang et al., 2011)。近几年来也有在褐飞虱中采取注射以及饲养法干扰成功的报道(Kanginakudru et al.，2007),如Flightin基因，Chitinaselike 家族基因，Chitin Deacetylase 家族基因和serine protease家族基因，它们能够成功干扰褐飞虱的相应功能，充分展现出RNAi技术用于防治农业害虫的前景。
双链RNA干扰最早在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中发现，通过RNAi干扰手段，dsRNA能诱导mRNA上的同源序列进行降解。细胞质中，RNaseIII中的Dicer将dsRNA切割为2123nt的单链RNA（siRNA），接着siRNA和RNA诱导沉默复合体（RISC）结合，切割mRNA上的同源靶标，从而阻止mRNA的翻译，干扰整个过程需要能量(Meister et al., 2004)。RNAi干扰技术由于其沉默机理的保守性和特异、高效、持久的优点，被广泛应用于褐飞虱的研究中。在本实验室中，我们用注射的方法将外源dsRNA导入褐飞虱体内：即使用显微注射仪将在体外合成的dsRNA注射入虫体内，注射部位为飞風胸部中足和后足间的外侧表皮处，然后在人工气候养虫室进行饲养。实验室具有一套完整的RNAi注射体系，便于开展一系列基因沉默研究。
实验室前期为了鉴别褐飞虱中与翅型分化有关的细胞外配体，从位于胰岛素途径上游的类胰岛素多肽（ILPs）入手。在褐飞虱转录组与基因组中找到4个类胰岛素多肽基因：NlIlpl , NlIlp2 ，NlIlp3和NlIlp4。经过RNAi干扰，发现干扰沉默NlIlpl、NlIlp2、NlIlp4这三个基因对翅型比例没有什么影响，但沉默NlIlp3可以显著提高雌雄虫的短翅型比例（薛建，2015）。本实验就针对已发现的类胰岛素多肽NlIlpl4，探究单一类胰岛素多肽对生殖的调控影响。利用 RNA interference (RNAi)技术，对NlILPs（NlIlp14）进行单基因干扰，统计沉默NlILPs（NlIlp14）后5天与10天产卵量结果，发现沉默NlIlpl、NlIlp2、NlIlp4这三个基因对生殖没有什么影响，但沉默NlIlp3后其012h羽化雌虫5天与10天产卵量显著降低；因卵黄原蛋白 (vitellogenin，vg)与生殖密切相关，所以单基因干扰NlILPs（NlIlp14），测定其羽化02h雌虫的卵黄原蛋白表达量，发现沉默NlIlpl、NlIlp2、NlIlp4 对其vitellogenin表达量没有显著影响，但沉默NlIlp3后可以显著降低其vitellogenin表达量，为进一步证明NlIlp3调控生殖提供思路，同时也为褐飞虱的防治提供理论基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 4
1.2.1基本实验4
1.2.2实验方法6
2结果与分析7
2.1 RNAi干扰褐飞虱类胰岛素多肽基因对5天产卵量的影响7
2.2 RNAi干扰褐飞虱类胰岛素多肽基因对10天产卵量的影响8
2.3 RNAi干扰类胰岛素多肽对卵黄原蛋白表达的影响 9
3讨论9
总结10
创新10
致谢10
参考文献11
褐飞虱类胰岛素多肽对生殖的调控研究
引言
引言
褐飞虱为单食性昆虫，仅以野生稻和栽培水稻作为寄主（朱绍先等，1984）。它对水稻的危害主要通过以下三种形式：产卵危害，直接刺吸危害以及传播水稻病毒危害：以若虫、成虫群聚于水稻基部刺吸茎叶组织的汁液，刺吸时分泌的凝固性唾液会形成口针鞘，阻碍稻株体内养分以及水份疏导。虫量多、受害严重时会使稻株基部变黑，水稻倒伏瘫痪，俗称“虱烧”、“冒尖”或者“透天”。其取食产卵时，会产生大量伤 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
口，破坏输导组织，促使稻株水分流失，加速水稻枯萎，且有利于小球菌核病、水稻纹枯病的侵染危害，其排泄的“蜜露”，富含各种氨基酸与糖类，极易滋生霉菌(芮明方等, 2011)，此外褐飞虱还能传播齿叶矮缩病毒（RRSV）和水稻草状丛矮缩病毒（RGSV）(程家安, 1996)。
褐飞虱分布于东南亚、南亚、太平洋岛屿及日本、朝鲜和澳大利亚等地(洪乃桥等，2007)。而20世纪60年代，褐飞虱只在亚洲一部分国家爆发成灾（高希武等，2006），70年代以后，由于我国水稻品种更替，耕作技术改变，伴随着杂交水稻的大面积推广，褐飞虱逐步在全国范围内爆发。进入本世纪后，褐飞虱发生的数量以及危害程度更是逐年攀升，时有爆发，严重危害我国水稻的产量。
对于褐飞虱的防治，传统的手段有1、农业防治：加强田间肥水管理、改善栽培制度、培育抗性水稻品种等，绿色环保；2、生物防治：包括微生物防治、天敌防治以及利用植物多样性，但微生物防治受环境影响较大，而人工释放天敌成本较高；3、物理防治：一般采用频振式杀虫灯，利用趋光或者趋化性进行防治（秦小娃等，2011）；4、化学防治：指用农药控制害虫，快速高效，是目前最主要、最普遍的防治手段。但因为长期单一大面积的应用，褐飞虱对农药产生了严重的抗药性；据统计，褐飞虱对吡虫啉、氟虫腈、噻嗪酮、吡蚜酮抗药性发展为中等至高等抗性(李建群等, 2014; 刘成社等, 2011; 施德等, 2008)。因此现阶段的研究热点集中在绿色、环保、高效、可持续发展的新方向。
胰岛素：由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。经过近几十年的探索研究，胰岛素大家族现已十分壮大。其中包含了胰岛素（insulin）、松弛肽（relaxins）、类胰岛素生长因子（insulinlike growth factors，IGFs）、家蚕素（bombyxin）以及一些类胰岛素多肽（insulinlike peptides，ILPs）(Koman et al., 1996; Claeys et al., 2002)。
我们把昆虫中的胰岛素相似蛋白称为类胰岛素多肽，其信号通路作用多样化，同时也极为保守，研究成果最早在果蝇中揭示：以PI3K途径为主，有效调节细胞的增殖、生长和衰老等过程。这条通路包括IRs （Chico），PTEN （dPTEN），PI3K （Dp110Dp60），Akt/PKB （dAkt/dPKB），类胰岛素肽dILPs作用于dInR后，dInR直接或者通过Chico来激活PI3K/Akt信号通路，而dPTEN作用于PI3K，抑制PI3K/Akt信号通路，其活化的dAKT能磷酸化大量的蛋白质如：dTSC（Tuberous sclerosis complex）、shaggy/GSK3、dFOXO，这其中dFOXO是dAKT十分关键的靶标因子，dFOXO直接调控果蝇的356个基因，对胰岛素信号通路也具有反馈调节作用(Alic et al., 2011; Finch et al., 2001;Potter et al., 2001)。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，是指在细胞中导入内源或外源的和靶标基因mRNA编码区同源的RNA双链时，该mRNA会发生降解从而导致基因表达沉默的现象，此现象发生在转录后水平，所以也称作是转录后基因沉默。基于RNA interference (RNAi)技术对于害虫防治为一种全新的防治策略，本技术多用于基因组功能的研究，可为农业害虫防治提供靶标，且可利用转基因植物所介导的RNAi的成功，为农业害虫防治提供新途径，随着基因组以及转录组测序等生物技术的快速发展，筛选出能够通过RNAi干扰来防治害虫的靶标已成为可能(Li et al., 2013; Wang et al., 2011)。近几年来也有在褐飞虱中采取注射以及饲养法干扰成功的报道(Kanginakudru et al.，2007),如Flightin基因，Chitinaselike 家族基因，Chitin Deacetylase 家族基因和serine protease家族基因，它们能够成功干扰褐飞虱的相应功能，充分展现出RNAi技术用于防治农业害虫的前景。
双链RNA干扰最早在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中发现，通过RNAi干扰手段，dsRNA能诱导mRNA上的同源序列进行降解。细胞质中，RNaseIII中的Dicer将dsRNA切割为2123nt的单链RNA（siRNA），接着siRNA和RNA诱导沉默复合体（RISC）结合，切割mRNA上的同源靶标，从而阻止mRNA的翻译，干扰整个过程需要能量(Meister et al., 2004)。RNAi干扰技术由于其沉默机理的保守性和特异、高效、持久的优点，被广泛应用于褐飞虱的研究中。在本实验室中，我们用注射的方法将外源dsRNA导入褐飞虱体内：即使用显微注射仪将在体外合成的dsRNA注射入虫体内，注射部位为飞風胸部中足和后足间的外侧表皮处，然后在人工气候养虫室进行饲养。实验室具有一套完整的RNAi注射体系，便于开展一系列基因沉默研究。
实验室前期为了鉴别褐飞虱中与翅型分化有关的细胞外配体，从位于胰岛素途径上游的类胰岛素多肽（ILPs）入手。在褐飞虱转录组与基因组中找到4个类胰岛素多肽基因：NlIlpl , NlIlp2 ，NlIlp3和NlIlp4。经过RNAi干扰，发现干扰沉默NlIlpl、NlIlp2、NlIlp4这三个基因对翅型比例没有什么影响，但沉默NlIlp3可以显著提高雌雄虫的短翅型比例（薛建，2015）。本实验就针对已发现的类胰岛素多肽NlIlpl4，探究单一类胰岛素多肽对生殖的调控影响。利用 RNA interference (RNAi)技术，对NlILPs（NlIlp14）进行单基因干扰，统计沉默NlILPs（NlIlp14）后5天与10天产卵量结果，发现沉默NlIlpl、NlIlp2、NlIlp4这三个基因对生殖没有什么影响，但沉默NlIlp3后其012h羽化雌虫5天与10天产卵量显著降低；因卵黄原蛋白 (vitellogenin，vg)与生殖密切相关，所以单基因干扰NlILPs（NlIlp14），测定其羽化02h雌虫的卵黄原蛋白表达量，发现沉默NlIlpl、NlIlp2、NlIlp4 对其vitellogenin表达量没有显著影响，但沉默NlIlp3后可以显著降低其vitellogenin表达量，为进一步证明NlIlp3调控生殖提供思路，同时也为褐飞虱的防治提供理论基础。
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