cpx双组份调控系统对植物病原细菌致病性作用机理的研究
摘要：本研究克隆了丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea）CpxP蛋白，构建蛋白质表达载体并表达和纯化，研究该CpxP蛋白在大豆细菌性斑点病菌致病性中的作用。PCR扩增出cpxP基因片段，验证正确后，将获得的片段构建于表达载体pET30a(+)上，并转化到表达菌株大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE检测结果表明cpxP片段能正常表达，蛋白大小与理论值相符。将所得纯蛋白在烟草上检测其激发烟草过敏反应的能力，结果显示，CpxP蛋白能够在烟草上激发肉眼可见的过敏反应。并且采用离体离体喷雾接种法在大豆叶片上检测发现CpxP蛋白对该细菌引起的大豆细菌性斑点病有防治作用。
目录
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1实验材料 2
1.2.1 丁香假单胞菌基因组的提取方法........................................................................................................2
1.2.2引物设计及片段特征 3
1.2.3 PCR扩增反应体系 4
1.2.4纯化PCR产物 4
1.2.5使用pMD18T载体对目的片段进行TA克隆 5
1.2.6连接产物的转化 5
1.2.7质粒的提取 5
1.2.8质粒酶切及PCR验证 6
1.2.9构建重组质粒 6
1.2.10重组质粒的转化 6
1.2.11重组质粒的PCR筛选及验证 6
1.2.12活化表达菌株，提取粗蛋白 6
1.2.13 SDSPAGE凝胶电泳检测 6
1.2.14镍柱清洗及蛋白纯化 6
1.2.15纯化CpxP蛋白的浓度测定 7
1.2.16 CpxP蛋白对大豆细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringea pv. glycinea）致病能力的影响作用离体测定.................
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
.............................................................................................................................................7
2 结果与分析 8
2．1重组表达载体构建的验证.....................................................................................................................8
2.1.1丁香假单胞菌大豆致病变种cpxP基因功能片段的克隆与表达载体构建 .8
2．2 cpxP功能片段的蛋白表达和纯化.......................................................................................................10
2.2.1 cpxP功能片段的蛋白表达...................................................................................................................10
2.2.2粗蛋白的纯化........................................................................................................................................10
2.2.3蛋白纯化后浓度测定............................................................................................................................11
2．3 cpxP功能片段在烟草上的过敏反应...................................................................................................11
2.3.1 cpxP功能片段表达蛋白激发烟草产生HR检测结果.......................................................................11
2．4 cpxP功能片段表达蛋白对丁香假单胞菌大豆致病变种的影响.......................................................12
2.4.1 cpxP功能片段表达蛋白对大豆细菌性斑点病的致病作用影响检测结果......................................12
3 讨论........................................................................................................................................................... 13
4 致谢............................................................................................................................................................13
参考文献........................................................................................................................................................14
Cpx双组份调控系统对植物病原细菌致病性作用机理的研究
引言
双组分调控系统（twocomponent system，TCS）是原核生物中最主要的信号转导系统，典型的双组分调节系统通常由感应蛋白组氨酸激酶（histidine kinase，HK）和效应调节蛋白（response regulator，RR）组成[1]。TCS由两个不同的基因编码，这两个基因通常是相邻的，而且常组成一个操纵子。感应蛋白主要是膜蛋白激酶，由感受外界刺激不稳定的输入域和另一个高度保守的激酶活性中心多结构域组成[2]，调节蛋白通常是胞质转录激活蛋白，由另一个高度保守的接受域和执行反应调节功能的输出域组成。HK活性中心具有自动磷酸化，磷酸基团转移和去磷酸化三种功能。当HK的输入域感受外界刺激时，HK可自动磷酸化并将该磷酸基团转移到RR接受域（REC）的天冬氨酸上，磷酸化的RR可调节某些目标基因的转录而达到调节输出反应的能力[3]。
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关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1实验材料 2
1.2.1 丁香假单胞菌基因组的提取方法........................................................................................................2
1.2.2引物设计及片段特征 3
1.2.3 PCR扩增反应体系 4
1.2.4纯化PCR产物 4
1.2.5使用pMD18T载体对目的片段进行TA克隆 5
1.2.6连接产物的转化 5
1.2.7质粒的提取 5
1.2.8质粒酶切及PCR验证 6
1.2.9构建重组质粒 6
1.2.10重组质粒的转化 6
1.2.11重组质粒的PCR筛选及验证 6
1.2.12活化表达菌株，提取粗蛋白 6
1.2.13 SDSPAGE凝胶电泳检测 6
1.2.14镍柱清洗及蛋白纯化 6
1.2.15纯化CpxP蛋白的浓度测定 7
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2 结果与分析 8
2．1重组表达载体构建的验证.....................................................................................................................8
2.1.1丁香假单胞菌大豆致病变种cpxP基因功能片段的克隆与表达载体构建 .8
2．2 cpxP功能片段的蛋白表达和纯化.......................................................................................................10
2.2.1 cpxP功能片段的蛋白表达...................................................................................................................10
2.2.2粗蛋白的纯化........................................................................................................................................10
2.2.3蛋白纯化后浓度测定............................................................................................................................11
2．3 cpxP功能片段在烟草上的过敏反应...................................................................................................11
2.3.1 cpxP功能片段表达蛋白激发烟草产生HR检测结果.......................................................................11
2．4 cpxP功能片段表达蛋白对丁香假单胞菌大豆致病变种的影响.......................................................12
2.4.1 cpxP功能片段表达蛋白对大豆细菌性斑点病的致病作用影响检测结果......................................12
3 讨论........................................................................................................................................................... 13
4 致谢............................................................................................................................................................13
参考文献........................................................................................................................................................14
Cpx双组份调控系统对植物病原细菌致病性作用机理的研究
引言
双组分调控系统（twocomponent system，TCS）是原核生物中最主要的信号转导系统，典型的双组分调节系统通常由感应蛋白组氨酸激酶（histidine kinase，HK）和效应调节蛋白（response regulator，RR）组成[1]。TCS由两个不同的基因编码，这两个基因通常是相邻的，而且常组成一个操纵子。感应蛋白主要是膜蛋白激酶，由感受外界刺激不稳定的输入域和另一个高度保守的激酶活性中心多结构域组成[2]，调节蛋白通常是胞质转录激活蛋白，由另一个高度保守的接受域和执行反应调节功能的输出域组成。HK活性中心具有自动磷酸化，磷酸基团转移和去磷酸化三种功能。当HK的输入域感受外界刺激时，HK可自动磷酸化并将该磷酸基团转移到RR接受域（REC）的天冬氨酸上，磷酸化的RR可调节某些目标基因的转录而达到调节输出反应的能力[3]。
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