大豆疫霉糖苷水解酶gh19基因家族的生物信息学分析与生物学功能研究
大豆疫霉是一种大豆卵菌病害。由于其经济重要性，大豆疫霉已成为研究卵菌生理学、遗传学和病理学的模式物种。本实验前期初步发现大豆疫霉糖苷水解酶基因家族GH19的一个基因PsGH19在大豆疫霉侵染过程中显著上调，其编码的蛋白质有信号肽和跨膜结构域，为分泌蛋白。将该基因与其他物种中的同源基因进行序列比对，发现GH19基因相对保守。利用CRISPER/Cas9系统对大豆疫霉进行快速有效的基因组编辑，以PsGH19基因为靶标，在同源模板缺少的情况下，由Cas9介导DNA双链断裂进而引起了缺失，获得大豆疫霉PsGH19基因沉默的转化株。对转化子进行表型分析发现与野生型P6497相比，敲除转化子的生长速率显著下降，卵孢子的形成与产量明显减少，说明该基因参与大豆疫霉有性生殖的过程，对大豆根腐病的防控提供理论基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 GH19基因的生物信息学分析 2
1.1.1 基因组数据来源 2
1.1.2 基因同源检索与多重序列比对 2
1.1.3 蛋白质结构预测 2
1.2 供试菌株 3
1.3 培养基的制备 3
1.4 CRISPR/Cas9技术对GH19基因的敲除 3
1.4.1 sgRNA的设计 3
1.4.2 大豆疫霉CRISPR/Cas9系统的构建 3
1.5 大豆疫霉瞬时转化 4
1.5.1 试剂和材料 4
1.5.2 大豆疫霉瞬时转化的具体步骤 5
1.6 大豆疫霉菌丝基因组DNA的提取 6
1.7 大豆疫霉敲除转化子表型分析 6
1.7.1 转化子生长速率的统计 6
1.7.2 转化子卵孢子产量测定 7
2 结果与分析 7
2.1 大豆疫霉基因组中GH19蛋白序列分析 7
2.2 大豆疫霉基因敲除转化子的获得 8
2.3 PsGH19转化子生长速率减慢 8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.4 PsGH19基因敲除影响大豆疫霉有性生殖 9
3 讨论 9
致谢 11
参考文献 12
附表1 13
附图1 15
大豆疫霉糖苷水解酶GH19基因家族的
生物信息学分析与生物学功能研究
引言
卵菌是一类包括疫霉、水霉、绵霉、腐霉、霜霉和白锈等多种动植物病原物在内的真核微生物[1]。其中的疫霉属（Phytophthora）是一类重要的植物病原菌群体，该属的100多种中绝大多数可以侵染双子叶植物，对于农业生产和生态环境具有严重破坏作用[2]。大豆疫霉（Phytophthora sojae）属于茸鞭生物界卵菌门疫霉属，能够侵染大豆引起根腐病，是大豆生产上的一种毁灭性病害，全球由于大豆根腐病导致的经济损失每年高达十几亿美元[3]。相对于细菌与真菌，疫霉菌基因组较大，并且遗传转化困难，疫霉菌致病机理的研究进展非常缓慢。但是，卵菌遗传转化和植物瞬时转化技术不断成熟[2],大豆疫霉基因组序列测序完成，在生物信息学的技术前提下，以外泌蛋白为对象的卵菌致病机理的研究逐渐取得了一系列突破性的进展[4]。
病原体的水解酶通过宿主大分子的降解及次级代谢物的解毒是引起植物发病的主要途径[5]。碳水化合物活性酶可以降解植物细胞壁聚合物，以允许病原体侵入植物组织并为病原体提供营养物质[6]。这些酶包含果胶酶、纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶和木葡聚糖酶。一些物种编码碳水化合物活性酶基因的缺失影响病原菌对植物的侵染。在炭疽菌属中，果胶裂解酶基因CcpelA的缺失导致侵染绿色番茄果实的毒力实质性损失[7]，而在赤叶枯刺盘孢菌中，果胶裂解酶基因PelB的缺失降低了对鳄梨（美洲山茱萸果实）的毒力 [8]。然而，大部分细胞壁降解酶（Cell Wall Degrading Enzymes, CWDEs）在毒力中的特定作用仍然很大程度上未知，尤其是在卵菌纲中。
植物的先天免疫系统已经进化为检测CWDE作为免疫应答的诱导物[9]。由CWDEs产生的一些植物细胞壁片段可以在植物中引发防御反应。然而，可以由植物的先天免疫系统检测的微生物的全部水解酶仍然大部分未被发现。在P. sojae和P. ramorum中鉴定来自糖基水解酶家族12的总共18种旁系同源的木葡聚糖特异性内切葡聚糖酶（EGL），这些基因编码预测的细胞外酶能够水解宿主细胞壁的木葡聚糖组分[10]。由大豆疫霉菌产生的具有木葡聚糖酶和β葡聚糖酶活性的糖苷水解酶家族12（GH12）蛋白——XEG1，加强了P. sojae的毒力[11]。
碳水化合物活性酶（CarbohydrateActive enzymes，CAZymes）包含多种植物细胞壁降解酶。植物病原菌可产生CWDE来降解寄主细胞壁，从而帮助其侵入植物组织。然而，大豆疫霉等植物病原卵菌中大多数细胞壁降解酶基因的生物学功能尚未被揭示，糖苷水解酶基因家族19的研究也很少有报道。糖苷水解酶是一类水解两个或多个糖类之间的糖苷键或一个糖类与非糖类之间的碳水化物部分的内效酶类（EC 3.2.1.14）, 其催化聚合物中β1,4N乙酰基D葡糖胺键水解[12]。碳水化合物活性酶涉及碳水化合物和糖复合物代谢，包括糖苷水解酶（GH）、糖基转移酶（GT）、多糖裂解酶（PL）和碳水化合物酯酶（CE）[13]。在大部分情况下，糖苷键的水解是由酶的两个氨基酸残基催化的，其催化残基是两个谷氨酸盐，一个位于第三alpha螺旋的末端，起催化剂的通用酸的作用，另一个位于可变的环状结构，充当催化通用碱[14]。糖苷水解酶家族19基因编码的蛋白质具有几丁质酶活性，随机水解分离几丁质和壳糊精的糖苷键。
本研究前期初步发现糖苷水解酶GH19家族（Glycoside Hydrolase family 19）的一个基因在大豆疫霉侵染大豆过程中显著上调表达，其编码的蛋白含有信号肽，推测该家族基因可能与大豆疫霉的致病等过程相关。了解大豆疫霉在侵染植物组织过程中的分子作用机制可对发展长期有效的控制措施提供理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 GH19基因的生物信息学分析 2
1.1.1 基因组数据来源 2
1.1.2 基因同源检索与多重序列比对 2
1.1.3 蛋白质结构预测 2
1.2 供试菌株 3
1.3 培养基的制备 3
1.4 CRISPR/Cas9技术对GH19基因的敲除 3
1.4.1 sgRNA的设计 3
1.4.2 大豆疫霉CRISPR/Cas9系统的构建 3
1.5 大豆疫霉瞬时转化 4
1.5.1 试剂和材料 4
1.5.2 大豆疫霉瞬时转化的具体步骤 5
1.6 大豆疫霉菌丝基因组DNA的提取 6
1.7 大豆疫霉敲除转化子表型分析 6
1.7.1 转化子生长速率的统计 6
1.7.2 转化子卵孢子产量测定 7
2 结果与分析 7
2.1 大豆疫霉基因组中GH19蛋白序列分析 7
2.2 大豆疫霉基因敲除转化子的获得 8
2.3 PsGH19转化子生长速率减慢 8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.4 PsGH19基因敲除影响大豆疫霉有性生殖 9
3 讨论 9
致谢 11
参考文献 12
附表1 13
附图1 15
大豆疫霉糖苷水解酶GH19基因家族的
生物信息学分析与生物学功能研究
引言
卵菌是一类包括疫霉、水霉、绵霉、腐霉、霜霉和白锈等多种动植物病原物在内的真核微生物[1]。其中的疫霉属（Phytophthora）是一类重要的植物病原菌群体，该属的100多种中绝大多数可以侵染双子叶植物，对于农业生产和生态环境具有严重破坏作用[2]。大豆疫霉（Phytophthora sojae）属于茸鞭生物界卵菌门疫霉属，能够侵染大豆引起根腐病，是大豆生产上的一种毁灭性病害，全球由于大豆根腐病导致的经济损失每年高达十几亿美元[3]。相对于细菌与真菌，疫霉菌基因组较大，并且遗传转化困难，疫霉菌致病机理的研究进展非常缓慢。但是，卵菌遗传转化和植物瞬时转化技术不断成熟[2],大豆疫霉基因组序列测序完成，在生物信息学的技术前提下，以外泌蛋白为对象的卵菌致病机理的研究逐渐取得了一系列突破性的进展[4]。
病原体的水解酶通过宿主大分子的降解及次级代谢物的解毒是引起植物发病的主要途径[5]。碳水化合物活性酶可以降解植物细胞壁聚合物，以允许病原体侵入植物组织并为病原体提供营养物质[6]。这些酶包含果胶酶、纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶和木葡聚糖酶。一些物种编码碳水化合物活性酶基因的缺失影响病原菌对植物的侵染。在炭疽菌属中，果胶裂解酶基因CcpelA的缺失导致侵染绿色番茄果实的毒力实质性损失[7]，而在赤叶枯刺盘孢菌中，果胶裂解酶基因PelB的缺失降低了对鳄梨（美洲山茱萸果实）的毒力 [8]。然而，大部分细胞壁降解酶（Cell Wall Degrading Enzymes, CWDEs）在毒力中的特定作用仍然很大程度上未知，尤其是在卵菌纲中。
植物的先天免疫系统已经进化为检测CWDE作为免疫应答的诱导物[9]。由CWDEs产生的一些植物细胞壁片段可以在植物中引发防御反应。然而，可以由植物的先天免疫系统检测的微生物的全部水解酶仍然大部分未被发现。在P. sojae和P. ramorum中鉴定来自糖基水解酶家族12的总共18种旁系同源的木葡聚糖特异性内切葡聚糖酶（EGL），这些基因编码预测的细胞外酶能够水解宿主细胞壁的木葡聚糖组分[10]。由大豆疫霉菌产生的具有木葡聚糖酶和β葡聚糖酶活性的糖苷水解酶家族12（GH12）蛋白——XEG1，加强了P. sojae的毒力[11]。
碳水化合物活性酶（CarbohydrateActive enzymes，CAZymes）包含多种植物细胞壁降解酶。植物病原菌可产生CWDE来降解寄主细胞壁，从而帮助其侵入植物组织。然而，大豆疫霉等植物病原卵菌中大多数细胞壁降解酶基因的生物学功能尚未被揭示，糖苷水解酶基因家族19的研究也很少有报道。糖苷水解酶是一类水解两个或多个糖类之间的糖苷键或一个糖类与非糖类之间的碳水化物部分的内效酶类（EC 3.2.1.14）, 其催化聚合物中β1,4N乙酰基D葡糖胺键水解[12]。碳水化合物活性酶涉及碳水化合物和糖复合物代谢，包括糖苷水解酶（GH）、糖基转移酶（GT）、多糖裂解酶（PL）和碳水化合物酯酶（CE）[13]。在大部分情况下，糖苷键的水解是由酶的两个氨基酸残基催化的，其催化残基是两个谷氨酸盐，一个位于第三alpha螺旋的末端，起催化剂的通用酸的作用，另一个位于可变的环状结构，充当催化通用碱[14]。糖苷水解酶家族19基因编码的蛋白质具有几丁质酶活性，随机水解分离几丁质和壳糊精的糖苷键。
本研究前期初步发现糖苷水解酶GH19家族（Glycoside Hydrolase family 19）的一个基因在大豆疫霉侵染大豆过程中显著上调表达，其编码的蛋白含有信号肽，推测该家族基因可能与大豆疫霉的致病等过程相关。了解大豆疫霉在侵染植物组织过程中的分子作用机制可对发展长期有效的控制措施提供理论依据。
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