细尖潜根线虫的分离与鉴定
潜根线虫(Hirschmanniella spp.)是水稻生产上一类重要的病原线虫，寄生于水稻和水生植物根部，目前该线虫在全世界水稻生产地区皆有分布。就国内而言，广东、福建、云南、浙江、安徽等省相继报道了潜根线虫在水稻上的危害。然而，作为我国重要稻区的江苏省，有关潜根线虫危害水稻的研究尚未报道。作者从江苏南京水稻根中检测到大量潜根线虫，经形态学显微观察及利用Deman公式进行多种形态学参数的计算，初步认为细尖潜根线虫(H. mucronata)为优势种群。通过rDNA-ITS-PCR扩增、电泳检测及进化树图谱等分析，进一步确认所分离到的线虫为细尖潜根线虫(H. mucronata)。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1水稻品种2
1.1.2线虫2
1.2方法 2
1.2.1线虫样本采集和分离2
1.2.2线虫形态观察2
1.2.3分子生物学鉴定2
1.2.4序列比对和进化树构建3
2结果与分析3
2.1形态学鉴定3
2.1.1形态学观察及数值测量3
2.1.2鉴别特征分析4
2.2分子生物学鉴定4
3讨论 5
3.1品种选择和地理环境 5
3.2水稻发育阶段 6
致谢6
参考文献6
细尖潜根线虫的分离与鉴定
引言
引言
水稻是世界上很多国家重要的粮食作物，其根部生活着多种植物寄生线虫或腐生线虫[1]，危害严重的就有潜根线虫（ Hirschmanniella spp.），并广泛分布于各类水稻田[2]。潜根线虫在分类地位上，隶属于线虫纲（Nematoda）,垫刃目（Tylenchida）,垫刃亚目（Tylenchina）、垫刃总科（Tylenchoidea）、短体线虫科(Pratylenchidae）、潜根线虫属(Hirschmanniella)。潜根线虫属下有很多种，在水 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
稻根部往往表现出混合种群共同侵染。在研究过程中，作者也发现了潜根线虫的混合虫口现象。这种现象普遍存在，一块稻田甚至一株稻草都潜伏着两种或两种以上的潜根线虫种群。该类线虫一般从水稻幼嫩根尖端部侵入，渐移动进人根内皮层和中柱之间吸取营养，影响根系的正常生长发育，引起水稻早衰[3]。受害稻株地上部常无明显的症状表现，但分蘖明显减少，千粒重减轻、产量降低。据报道，全世界58％的水稻田遭受潜根线虫感染，导致水稻减产1030%；而防治该线虫的主要依赖杀线虫剂进行土壤处理。潜根线虫寄生在水稻的根系，植株地上部无明显和特殊的症状，故而潜根线虫病害尚未引起人们的注意和重视。据国外试验，适当防治潜根线虫能显著提高水稻产量[4]。因此加强这类线虫的研究，探讨经济有效的方法对促进我省水稻增产具有积极作用。
水稻潜根线虫病广泛分布在世界各水稻产区，在我国也较普遍发生。我国在80年代发现潜根线虫病[5]，之后随着种子苗木运输更加频繁，相继有研究证实福建[6] 、广东[7]、湖南、云南[8] 、安徽[9]、浙江以及台湾[10]等稻区发现潜根线虫。尽管如此,江苏省水稻潜根线虫的发生尚未见报道。本研究从江苏省农业科学院的水稻田随机多次采取几株长势较差的水稻植株，从其根部提取到大量的潜根线虫，通过形态学和分子生物学鉴定，这些潜根线虫中有些水稻潜根线虫，但主要是细尖潜根线虫(H. mucronata），本研究数量较突出的仍然是细尖潜根线虫。
1 材料与方法
1．1 材料
本研究的实验材料取自江苏省农科院水稻品种实验基地的水稻。
1．1.1 水稻品种 南粳46
1．1.2 线虫 线虫采自江苏省农科院水稻品种试验基地的水稻根，完全洗去根表土壤以排除根际土壤的外寄生线虫和腐生线虫后，将稻根剪成1cm长的根段，用贝曼漏斗法分离组织内的潜根线虫（Hirschmanniella spp）。线虫种类经鉴定确认为细尖潜根线虫。
1．2 方法
2.1 线虫样本采集和分离
本研究水稻样本采集自江苏省农业科学院水稻试验田（32°1 E, 118°52N），水稻品种为南粳46。随机选取发病田块拔节期水稻10株，将水稻整株挖出（附带根部泥土）带回实验室，分别分离水稻地上部和根部线虫。地上部（茎秆中基部和叶片）分别用剪刀剪碎，采用贝曼漏斗法进行分离。对于地下部分，小心去除根围大块泥土，只保留与根接触紧密的土壤，尽量避免根断裂。称量带土稻根重量，随后用自来水将根部土壤彻底冲洗干净，用吸水纸擦去根表面水分，称重，则根围土壤重量为带土根重减去根重。洗掉的泥水经筛网逐级过滤后直接进行显微镜检查；洗干净的根用剪刀剪成1cm长根段，采用漏斗法进行线虫分离。24小时后，收集漏斗装置中分离的线虫，在体式显微镜（Leica M125，德国）下分别检测稻根、根围土壤、茎秆中基部以及叶片中的线虫数量，利用GraphPad Prism 5进行数据分析和绘图。
1.2.2 线虫形态学观察
分别采用普通光学显微镜和扫描电子显微镜对所提取到的线虫进行形态学鉴定。用线虫挑针挑取以上分离到的线虫，于65℃水浴温热杀死，用FAA固定液固定后制成临时玻片。通过光学显微镜观察雌虫和雄虫的虫体形态，利用View软件拍摄，同时测算deMan值和其他形态参数值。
扫描电子显微镜按照以下过程操作：挑取从根部分离的纯净线虫至洁净离心管中，经超声洗涤机去除虫体表片附着物。离心收集约500头洗净的线虫加入2%戊二醛固定120 min，再用磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min。然后依次用50%、70%、80%、90%和100%乙醇脱水，每次15 min。脱水后的线虫经冷冻干燥机干燥后，用双面胶带将线虫粘到样品台上，并用离子溅射仪给样品镀10 nm金膜。本实验采用日立S3000N扫描电子显微镜对线虫进行观察。
1.2.3 分子生物学鉴定
随机挑取从水稻根内分离到的20条线虫，参考Spiridonov和Moens [11]的方法进行DNA提取，略做修改：在解剖镜下，挑取单条线虫置于滴有10μl ddH2O2的载玻片，用挑针切断虫体使虫体内含物释放出来。吸取该线虫裂解液至内盛8 μl WLB缓冲液（500 mM KCl, 100 mM TrisHCl (pH 8.0), 15 mM MgCl2, 1.0 mM DTT和4.5 % Tween 20）的PCR管中，加入12 μl 蛋白酶K（100 μg/ml），于70℃放置20min后于65℃孵育1h，再95℃ 10min，最后12000rpm离心1min，吸取上清用于PCR扩增。本实验随机选取不同虫态的线虫进行PCR反应，两个引物对，分别是：
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1水稻品种2
1.1.2线虫2
1.2方法 2
1.2.1线虫样本采集和分离2
1.2.2线虫形态观察2
1.2.3分子生物学鉴定2
1.2.4序列比对和进化树构建3
2结果与分析3
2.1形态学鉴定3
2.1.1形态学观察及数值测量3
2.1.2鉴别特征分析4
2.2分子生物学鉴定4
3讨论 5
3.1品种选择和地理环境 5
3.2水稻发育阶段 6
致谢6
参考文献6
细尖潜根线虫的分离与鉴定
引言
引言
水稻是世界上很多国家重要的粮食作物，其根部生活着多种植物寄生线虫或腐生线虫[1]，危害严重的就有潜根线虫（ Hirschmanniella spp.），并广泛分布于各类水稻田[2]。潜根线虫在分类地位上，隶属于线虫纲（Nematoda）,垫刃目（Tylenchida）,垫刃亚目（Tylenchina）、垫刃总科（Tylenchoidea）、短体线虫科(Pratylenchidae）、潜根线虫属(Hirschmanniella)。潜根线虫属下有很多种，在水 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
稻根部往往表现出混合种群共同侵染。在研究过程中，作者也发现了潜根线虫的混合虫口现象。这种现象普遍存在，一块稻田甚至一株稻草都潜伏着两种或两种以上的潜根线虫种群。该类线虫一般从水稻幼嫩根尖端部侵入，渐移动进人根内皮层和中柱之间吸取营养，影响根系的正常生长发育，引起水稻早衰[3]。受害稻株地上部常无明显的症状表现，但分蘖明显减少，千粒重减轻、产量降低。据报道，全世界58％的水稻田遭受潜根线虫感染，导致水稻减产1030%；而防治该线虫的主要依赖杀线虫剂进行土壤处理。潜根线虫寄生在水稻的根系，植株地上部无明显和特殊的症状，故而潜根线虫病害尚未引起人们的注意和重视。据国外试验，适当防治潜根线虫能显著提高水稻产量[4]。因此加强这类线虫的研究，探讨经济有效的方法对促进我省水稻增产具有积极作用。
水稻潜根线虫病广泛分布在世界各水稻产区，在我国也较普遍发生。我国在80年代发现潜根线虫病[5]，之后随着种子苗木运输更加频繁，相继有研究证实福建[6] 、广东[7]、湖南、云南[8] 、安徽[9]、浙江以及台湾[10]等稻区发现潜根线虫。尽管如此,江苏省水稻潜根线虫的发生尚未见报道。本研究从江苏省农业科学院的水稻田随机多次采取几株长势较差的水稻植株，从其根部提取到大量的潜根线虫，通过形态学和分子生物学鉴定，这些潜根线虫中有些水稻潜根线虫，但主要是细尖潜根线虫(H. mucronata），本研究数量较突出的仍然是细尖潜根线虫。
1 材料与方法
1．1 材料
本研究的实验材料取自江苏省农科院水稻品种实验基地的水稻。
1．1.1 水稻品种 南粳46
1．1.2 线虫 线虫采自江苏省农科院水稻品种试验基地的水稻根，完全洗去根表土壤以排除根际土壤的外寄生线虫和腐生线虫后，将稻根剪成1cm长的根段，用贝曼漏斗法分离组织内的潜根线虫（Hirschmanniella spp）。线虫种类经鉴定确认为细尖潜根线虫。
1．2 方法
2.1 线虫样本采集和分离
本研究水稻样本采集自江苏省农业科学院水稻试验田（32°1 E, 118°52N），水稻品种为南粳46。随机选取发病田块拔节期水稻10株，将水稻整株挖出（附带根部泥土）带回实验室，分别分离水稻地上部和根部线虫。地上部（茎秆中基部和叶片）分别用剪刀剪碎，采用贝曼漏斗法进行分离。对于地下部分，小心去除根围大块泥土，只保留与根接触紧密的土壤，尽量避免根断裂。称量带土稻根重量，随后用自来水将根部土壤彻底冲洗干净，用吸水纸擦去根表面水分，称重，则根围土壤重量为带土根重减去根重。洗掉的泥水经筛网逐级过滤后直接进行显微镜检查；洗干净的根用剪刀剪成1cm长根段，采用漏斗法进行线虫分离。24小时后，收集漏斗装置中分离的线虫，在体式显微镜（Leica M125，德国）下分别检测稻根、根围土壤、茎秆中基部以及叶片中的线虫数量，利用GraphPad Prism 5进行数据分析和绘图。
1.2.2 线虫形态学观察
分别采用普通光学显微镜和扫描电子显微镜对所提取到的线虫进行形态学鉴定。用线虫挑针挑取以上分离到的线虫，于65℃水浴温热杀死，用FAA固定液固定后制成临时玻片。通过光学显微镜观察雌虫和雄虫的虫体形态，利用View软件拍摄，同时测算deMan值和其他形态参数值。
扫描电子显微镜按照以下过程操作：挑取从根部分离的纯净线虫至洁净离心管中，经超声洗涤机去除虫体表片附着物。离心收集约500头洗净的线虫加入2%戊二醛固定120 min，再用磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min。然后依次用50%、70%、80%、90%和100%乙醇脱水，每次15 min。脱水后的线虫经冷冻干燥机干燥后，用双面胶带将线虫粘到样品台上，并用离子溅射仪给样品镀10 nm金膜。本实验采用日立S3000N扫描电子显微镜对线虫进行观察。
1.2.3 分子生物学鉴定
随机挑取从水稻根内分离到的20条线虫，参考Spiridonov和Moens [11]的方法进行DNA提取，略做修改：在解剖镜下，挑取单条线虫置于滴有10μl ddH2O2的载玻片，用挑针切断虫体使虫体内含物释放出来。吸取该线虫裂解液至内盛8 μl WLB缓冲液（500 mM KCl, 100 mM TrisHCl (pH 8.0), 15 mM MgCl2, 1.0 mM DTT和4.5 % Tween 20）的PCR管中，加入12 μl 蛋白酶K（100 μg/ml），于70℃放置20min后于65℃孵育1h，再95℃ 10min，最后12000rpm离心1min，吸取上清用于PCR扩增。本实验随机选取不同虫态的线虫进行PCR反应，两个引物对，分别是：
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