细胞衰老中可变剪接与选择性多聚腺苷酸化的耦联关系研究
细胞衰老是一个重要的生物学过程，是个体衰老的基础，并且是一种重要的抗癌机制。在细胞衰老的过程中，伴随着一系列的生理生化过程，基因的表达也发生着剧烈的变化，包括转录层面的调控以及转录后调控。而转录过程中，可变剪接（Alternative Splicing，AS）和选择性多聚腺苷酸化（Alternative Polyadenylation，APA）是重要的调控过程，并且都对细胞衰老产生一定的影响，且在细胞衰老过程中发生着显著的变化。随着高通量测序技术，尤其是第二代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）的发展，研究人员对全基因组APA和AS 进行深度测序和分析，发现两者具有一定程度的耦联关系，而在衰老细胞中并不明确。本课题以小鼠胚胎成纤维细胞（MEF细胞）为研究对象，利用三代测序方法（即由Pacific Biotechnology公司研发的ISO-seq技术，能够测出RNA的全长数据）测得MEF细胞总RNA全长数据，经生物信息学分析后，对取得的部分结果进行报告。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言（或绪论）5
1材料与方法 6
1.1研究对象 6
1.2实验材料 6
1.2.1 MEF细胞传代培养试剂 6
1.2.2 βgal染色试剂 6
1.2.3 MEF细胞总RNA提取试剂 6
1.2.4 Qubit试剂 6
1.2.5 ISOseq测序试剂 7
1.2.6 实验仪器 7
1.3实验方法 7
1.3.1 MEF细胞传代培养 7
1.3.2 衰老细胞的βgal染色 7
1.3.3 MEF细胞总RNA提取 7
1.3.3.1 MEF细胞总RNA提取 7
1.3.3.2 RNAClean XP磁珠纯化 7
1.3.4 文库构建及上机测序 8
1.3.4.1 cDNA的合成 8
1.3.4.2 大规模PCR 8
1.3.4.3 用B *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
luePinpin?系统进行片段选择 8
1.3.4.4 SMRTbellTM 文库构建及上机测序 9
1.4生物信息学处理 9
2结果与分析 10
2.1衰老细胞的βgal染色结果 10
2.2 PCR循环数优化结果 10
2.3 Agilent 2100 Bioanalyzer进行RNA质检结果11
2.4测序所得数据情况 12
2.5 生物信息分析结果13
2.5.1对转录起始位点和poly（A）位点的统计13
2.5.2对具有多个poly（A）位点的功能聚类14
2.5.3对具有多个可变起始位点的功能聚类15
2.5.4衰老相关基因新的APA位点与转录起始位点耦联关系例证15
3讨论 16
3.1三代测序现状讨论 16
3.1生物信息分析结果讨论 17
致谢17
参考文献18
细胞衰老中可变剪接与选择性多聚腺苷酸化的耦联关系研究
引言
细胞衰老是指当细胞经历潜在的致癌应激时发生的细胞增殖（生长）上不可逆的停滞[1]。细胞衰老是一个重要的生物学过程，是个体衰老的基础，并且是一种重要的抗癌机制。在细胞衰老的过程中，伴随着一系列的生理生化过程，基因的表达也发生着剧烈的变化，包括转录层面的调控以及转录后调控[2]。而可变剪接（Alternative Splicing，AS）和选择性多聚腺苷酸化（Alternative Polyadenylation，APA）都是转录过程中的重要调控机制，它们的特殊功能影响着转录组和蛋白质组的多样性[3]。AS通过选择不同的剪接位点来导致外显子和内含子的跳跃和保留，而APA则通过对3′末端进行选择性的剪接和多聚腺苷酸化，生成不同的3′末端[4]。经报道，有超过90%的转录本在成熟的过程中会受到这两者的调控[5]。
有研究表明，人类基因组中超过半数的基因拥有多个APA位点[6]，即选择性多聚腺苷酸化广泛存在于人类基因组中，提高了转录组和蛋白质组的多样性。而APA分为两种类型（如图1所示）：当APA位点在内含子或者外显子上面时，会使3′末端的外显子产生缺失，从而生成具有不同C端结构域的蛋白质，这种类型的APA叫做编码区APA（coding regionAPA ，CRAPA）[7]；另外一种情况下，APA的位点在3′末端的非翻译区（3′untranslated region ，3′UTR）上，生成的转录本具有不一样的3′UTR，但是编码相同的蛋白质，这种类型的APA叫做3′末端的非翻译区APA（UTRAPA）。
而至少90%的人类基因会经历可变剪接，且每个基因至少产生四个变体[8]。可变剪接可以通过生成不同的RNA亚型，从而提高蛋白质的多样性。AS分为四种不同的类型（如图2所示）：外显子跳跃、内含子保留、可变5′UTR、可变3′UTR。
图2 AS的四种传统形式（引自Timothy et al, Nature, 2010, 463(7280):457）
Kim等[9]发现，在衰老个体的大脑中，许多基因的可变剪接方式如外显子跳跃等发生了显著的改变。本实验室以MEF细胞（即小鼠胚胎成纤维细胞）作为研究对象，发现了RNA的选择性多聚腺苷酸化在细胞衰老的过程中发生着明显的变化，其中的一些改变与细胞的衰老有着某种程度的联系，并且选择性多腺苷酸化水平的改变与基因的表达量之间存在着显著的相关性[10]。Eran Meshore等[11]证实，细胞衰老中RNA加工机器调控失衡，且可变剪接与选择性多聚腺苷酸化同时存在，对其产生影响。
近年来，第二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术飞速发展，有研究为了解决内含子APA的基本机制，使用iCLIP和RNAseq分析对APA的调节因子CstF64（cleavagestimulating factor 64，CstF64）进行研究显示CstF64结合数以千计的内含子poly（A）位点并激活它们[12]。有趣的是，这些内含子poly（A）位点被AS的调节因子U1 snRNP（U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 snRNP）抑制，其在前体mRNA可变剪接中起重要作用。然而，上游调节因子不限于异源核核糖核蛋白（hnRNP），也可以是富含丝氨酸/精氨酸（SR）的蛋白质。 SR蛋白是具有进化保守作用的必需RNA结合蛋白（RNA Binding Protein，RBP），是组成型和可变型前体mRNA的剪接调节子[13]。SR蛋白可以调节多种过程，如3′末端加工，mRNA稳定性和翻译。其中，SRSF3和SRSF7分别结合在末端外显子的不同位点，并以相反的方式调节3′UTR长度。但是SRSF3和SRSF7均促进了核RNA输出因子1（Nuclear RNA export factor 1，NXF1）的募集，NXF1是mRNA输出的因子。因此，SRSF3和SRSF7可能耦合可变剪接和多聚腺苷酸化以影响mRNA的输出，从而控制具有可变3′末端的转录物的细胞质丰度[14]。这些结果表明APA和AS具有一定的相互作用。然而目前，并未有报道揭露两者在衰老细胞中的具体耦联关系。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言（或绪论）5
1材料与方法 6
1.1研究对象 6
1.2实验材料 6
1.2.1 MEF细胞传代培养试剂 6
1.2.2 βgal染色试剂 6
1.2.3 MEF细胞总RNA提取试剂 6
1.2.4 Qubit试剂 6
1.2.5 ISOseq测序试剂 7
1.2.6 实验仪器 7
1.3实验方法 7
1.3.1 MEF细胞传代培养 7
1.3.2 衰老细胞的βgal染色 7
1.3.3 MEF细胞总RNA提取 7
1.3.3.1 MEF细胞总RNA提取 7
1.3.3.2 RNAClean XP磁珠纯化 7
1.3.4 文库构建及上机测序 8
1.3.4.1 cDNA的合成 8
1.3.4.2 大规模PCR 8
1.3.4.3 用B *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
luePinpin?系统进行片段选择 8
1.3.4.4 SMRTbellTM 文库构建及上机测序 9
1.4生物信息学处理 9
2结果与分析 10
2.1衰老细胞的βgal染色结果 10
2.2 PCR循环数优化结果 10
2.3 Agilent 2100 Bioanalyzer进行RNA质检结果11
2.4测序所得数据情况 12
2.5 生物信息分析结果13
2.5.1对转录起始位点和poly（A）位点的统计13
2.5.2对具有多个poly（A）位点的功能聚类14
2.5.3对具有多个可变起始位点的功能聚类15
2.5.4衰老相关基因新的APA位点与转录起始位点耦联关系例证15
3讨论 16
3.1三代测序现状讨论 16
3.1生物信息分析结果讨论 17
致谢17
参考文献18
细胞衰老中可变剪接与选择性多聚腺苷酸化的耦联关系研究
引言
细胞衰老是指当细胞经历潜在的致癌应激时发生的细胞增殖（生长）上不可逆的停滞[1]。细胞衰老是一个重要的生物学过程，是个体衰老的基础，并且是一种重要的抗癌机制。在细胞衰老的过程中，伴随着一系列的生理生化过程，基因的表达也发生着剧烈的变化，包括转录层面的调控以及转录后调控[2]。而可变剪接（Alternative Splicing，AS）和选择性多聚腺苷酸化（Alternative Polyadenylation，APA）都是转录过程中的重要调控机制，它们的特殊功能影响着转录组和蛋白质组的多样性[3]。AS通过选择不同的剪接位点来导致外显子和内含子的跳跃和保留，而APA则通过对3′末端进行选择性的剪接和多聚腺苷酸化，生成不同的3′末端[4]。经报道，有超过90%的转录本在成熟的过程中会受到这两者的调控[5]。
有研究表明，人类基因组中超过半数的基因拥有多个APA位点[6]，即选择性多聚腺苷酸化广泛存在于人类基因组中，提高了转录组和蛋白质组的多样性。而APA分为两种类型（如图1所示）：当APA位点在内含子或者外显子上面时，会使3′末端的外显子产生缺失，从而生成具有不同C端结构域的蛋白质，这种类型的APA叫做编码区APA（coding regionAPA ，CRAPA）[7]；另外一种情况下，APA的位点在3′末端的非翻译区（3′untranslated region ，3′UTR）上，生成的转录本具有不一样的3′UTR，但是编码相同的蛋白质，这种类型的APA叫做3′末端的非翻译区APA（UTRAPA）。
而至少90%的人类基因会经历可变剪接，且每个基因至少产生四个变体[8]。可变剪接可以通过生成不同的RNA亚型，从而提高蛋白质的多样性。AS分为四种不同的类型（如图2所示）：外显子跳跃、内含子保留、可变5′UTR、可变3′UTR。
图2 AS的四种传统形式（引自Timothy et al, Nature, 2010, 463(7280):457）
Kim等[9]发现，在衰老个体的大脑中，许多基因的可变剪接方式如外显子跳跃等发生了显著的改变。本实验室以MEF细胞（即小鼠胚胎成纤维细胞）作为研究对象，发现了RNA的选择性多聚腺苷酸化在细胞衰老的过程中发生着明显的变化，其中的一些改变与细胞的衰老有着某种程度的联系，并且选择性多腺苷酸化水平的改变与基因的表达量之间存在着显著的相关性[10]。Eran Meshore等[11]证实，细胞衰老中RNA加工机器调控失衡，且可变剪接与选择性多聚腺苷酸化同时存在，对其产生影响。
近年来，第二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术飞速发展，有研究为了解决内含子APA的基本机制，使用iCLIP和RNAseq分析对APA的调节因子CstF64（cleavagestimulating factor 64，CstF64）进行研究显示CstF64结合数以千计的内含子poly（A）位点并激活它们[12]。有趣的是，这些内含子poly（A）位点被AS的调节因子U1 snRNP（U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 snRNP）抑制，其在前体mRNA可变剪接中起重要作用。然而，上游调节因子不限于异源核核糖核蛋白（hnRNP），也可以是富含丝氨酸/精氨酸（SR）的蛋白质。 SR蛋白是具有进化保守作用的必需RNA结合蛋白（RNA Binding Protein，RBP），是组成型和可变型前体mRNA的剪接调节子[13]。SR蛋白可以调节多种过程，如3′末端加工，mRNA稳定性和翻译。其中，SRSF3和SRSF7分别结合在末端外显子的不同位点，并以相反的方式调节3′UTR长度。但是SRSF3和SRSF7均促进了核RNA输出因子1（Nuclear RNA export factor 1，NXF1）的募集，NXF1是mRNA输出的因子。因此，SRSF3和SRSF7可能耦合可变剪接和多聚腺苷酸化以影响mRNA的输出，从而控制具有可变3′末端的转录物的细胞质丰度[14]。这些结果表明APA和AS具有一定的相互作用。然而目前，并未有报道揭露两者在衰老细胞中的具体耦联关系。
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