枯草芽孢杆菌comer突变体的构建及其游动性研究
枯草芽孢杆菌作为一种理想的生防细菌，其生物膜形成能力与防病效果呈正相关。本研究通过突变体文库的筛选得到一个在枯草芽孢杆菌生物膜形成以及游动性发挥重要作用的基因—comER。并在枯草芽孢杆菌3610和SM21菌株中构建comER突变体。为确保comER突变体构建的准确性，又对突变体进行了回补验证。研究结果表明comER突变体能够导致枯草芽孢杆菌细胞游动性减弱,comER基因对枯草芽孢杆菌的游动性有负调控作用，但目前具体的调控机制尚不清楚。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract: 1
Keywords: 1
1 材料与方法 3
1.1 菌株及培养条件 3
1.2 酶和引物合成 3
1.3 枯草芽孢杆菌comER基因突变体构建 3
1.3.1 LFHPCR 3
1.3.2 LFHPCR产物转入枯草芽孢杆菌中同源重组构建突变体 4
1.4 枯草芽孢杆菌及解淀粉芽孢杆菌回补突变体构建 4
1.4.1 重组质粒pDG268构建 4
1.4.2 基因组转化 5
1.5 细菌游动性能力检测 5
2 结果与分析 6
2.1 枯草芽孢杆菌comER突变体的构建结果 6
2.1.1 LFHPCR最终产物 6
2.1.2 同源重组构建comER突变体产物 7
2.2 枯草芽孢杆菌及解淀粉芽孢杆菌回补突变体构建结果 8
2.2.1 pDG268重组质粒构建产物 8
2.2.2 回补突变体构建结果 9
2.3 comER突变体对枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌游动性能力的影响 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献： 11
表1 本研究所用菌株 3
表2 本研究使用的引物 3
表3 pDG268重组质粒测序结果 8
图1 LFHPCR示意图 3
图2 PCR扩增上下游同源臂F1F2 6
图3 第三轮PCR产物含spec *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
抗性基因片段 7
图4 comER突变体基因组中spec基因片段的PCR验证 7
图5 双酶切pDG268产物 8
图6 comER基因组DNA产物 9
图7 枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌野生型和comER突变体游动性能力比较 10
枯草芽孢杆菌comER突变体的构建及其游动性研究
引言
长期以来，化学农药一直是植物病害防治的主要方式，它在农业生产上发挥了十分重要的作用，但长期不合理使用化学农药产生了诸多问题。例如：化学农药的高毒、高残留不仅对土壤、水体、大气造成了严重的污染，破坏了生态平衡，也对人体、牲畜的健康产生了不良影响；同时，由于病原菌和害虫抗药性的不断增强，导致农药的使用频率和使用量不断加大，出现了用药量与病虫害相互递增的恶性循环，最后造成农产品中化学农药的残留量增加，对人、畜的健康安全造成了极大的威胁。一系列严重的问题促使人们开发一种对人类和环境友好型、具有良好防治效果的新的植物病虫害防治策略。
随着人们对食品安全的日益重视，可持续控制病虫害发展的需要，生物防治受到了各国政府和植物保护专家的重视。生物防治是指用生物代谢产物来控制病虫害的一项技术，是综合防治体系中一个必不可缺少的组成部分[1]。由于生物防治主要是运用自然界生物相生相克的原理，人为地增多在自然界中存在的对病虫害有相克作用的生物，来控制有害生物的危害，故避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境和能源方面的问题，避免了农药残留对人畜的危害，更重要的是生物防治促进了环境生态平衡，促进了农业的可持续发展，是一种环境友好的植保技术。近年来随着分子生物学技术、细胞工程、蛋白质工程、酶工程、发酵工程、基因工程等新技术的飞速发展，生物农药产生了巨大的社会和经济效益，表现出良好的应用前景。目前应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp. )、土壤放射杆菌(Agrobacterium radiobacter)等[2]。
枯草芽孢杆菌（Bacillus spp.）是目前生防细菌中研究较多的一类，广泛分布于各种不同生态环境中的革兰氏阳性细菌，呈杆状，在土壤和植物的表面普遍存在[3]。因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，对人和动物无毒害作用，不污染环境，同时，生长速度快，营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖与繁殖，是一种理想的生防微生物[4]。
枯草芽孢杆菌（B.subtilis）为革兰氏阳性菌，一直作为模式种来研究细菌的生长及孢子的形成过程。后来研究发现野生型B.subtulis菌株能在实验室条件中形成生物膜，也能在植物的根围形成致密的生物膜，保护植物不受植物病原细菌和真菌的侵染，对植物防御病原菌侵染有着重要的意义[5]。
相比生物膜形成能力较弱的菌株，生物膜形成能力更强的野生型枯草芽孢杆菌具有更好的生防效果。并且自然界土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌菌株都能形成粗糙的生物膜，而实验室驯化的菌株却不能形成生物膜，可以推测生物膜对枯草芽孢杆菌在自然界的适应生存能力有着重要作用[6]。通过进一步的实验探究得出生物膜增强突变体，防治效果增强，减弱突变体，生防活性也降低，因此可以推论枯草芽孢杆菌生物膜形成能力与防病效果呈正相关[7]。
comER是吡咯啉5羧酸酯还原酶，涉及到脯氨酸生物合成代谢最后一步[8]，根据在基因组中的位置以及在蛋白功能预测comER属于诱导感受态形成晚期过程中的基因。根据相关研究表明，在LBGM培养基中，培养48h后，野生型菌株已经形成明显的生物膜表征，而comER突变体则仅仅形成部分薄薄的没有明显特征的膜状片状物[9]。该结果表明comER可以调控生物膜形成，在枯草芽孢杆菌生物膜形成中具有重要作用。并且已有研究验证，在枯草芽孢杆菌中，comER的缺失并不会造成生长受限，进一步表明comER突变体生物膜形成能力的缺陷并不是生长受限引起的。
综上所述，可以推测枯草芽孢杆菌生物膜与生物防治存在正相关性，comER基因可以调控枯草芽孢杆菌生物膜形成，在生物膜形成中发挥重要作用。故comER基因的研究在枯草芽孢杆菌生防能力方面显得尤为重要。
1 材料与方法
1.1 菌株及培养条件
本研究中所选用的菌株为：枯草芽孢杆菌SM21和3610；解淀粉芽孢杆菌54。主要来源见表1。使用的培养基主要为：细菌生长常规培养基LB、 枯草芽孢杆菌转化培养基MC，培养温度为37℃，培养基配方如下：
LB（1 L）：10 g 蛋白胨，5 g 酵母粉，5 g 氯化钠；
MC（10 X ）：14.036 g/L K2HPO43H2O，5.239 g KH2PO4，20 g 葡萄糖，1 g casein，2g谷氨酸钾盐，1 ml 300 mM 柠檬酸三钠，1 ml 22 mg/ml 柠檬酸铁胺；
需使用的抗生素及相应终浓度为： 100 ugml1壮观霉素（Spectinomycin）、20ugml1卡那霉素（Kanamycin）、5ugml1氯霉素(Chloramphenicol)、100ugml1氨苄(Ampicillin)。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract: 1
Keywords: 1
1 材料与方法 3
1.1 菌株及培养条件 3
1.2 酶和引物合成 3
1.3 枯草芽孢杆菌comER基因突变体构建 3
1.3.1 LFHPCR 3
1.3.2 LFHPCR产物转入枯草芽孢杆菌中同源重组构建突变体 4
1.4 枯草芽孢杆菌及解淀粉芽孢杆菌回补突变体构建 4
1.4.1 重组质粒pDG268构建 4
1.4.2 基因组转化 5
1.5 细菌游动性能力检测 5
2 结果与分析 6
2.1 枯草芽孢杆菌comER突变体的构建结果 6
2.1.1 LFHPCR最终产物 6
2.1.2 同源重组构建comER突变体产物 7
2.2 枯草芽孢杆菌及解淀粉芽孢杆菌回补突变体构建结果 8
2.2.1 pDG268重组质粒构建产物 8
2.2.2 回补突变体构建结果 9
2.3 comER突变体对枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌游动性能力的影响 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献： 11
表1 本研究所用菌株 3
表2 本研究使用的引物 3
表3 pDG268重组质粒测序结果 8
图1 LFHPCR示意图 3
图2 PCR扩增上下游同源臂F1F2 6
图3 第三轮PCR产物含spec *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
抗性基因片段 7
图4 comER突变体基因组中spec基因片段的PCR验证 7
图5 双酶切pDG268产物 8
图6 comER基因组DNA产物 9
图7 枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌野生型和comER突变体游动性能力比较 10
枯草芽孢杆菌comER突变体的构建及其游动性研究
引言
长期以来，化学农药一直是植物病害防治的主要方式，它在农业生产上发挥了十分重要的作用，但长期不合理使用化学农药产生了诸多问题。例如：化学农药的高毒、高残留不仅对土壤、水体、大气造成了严重的污染，破坏了生态平衡，也对人体、牲畜的健康产生了不良影响；同时，由于病原菌和害虫抗药性的不断增强，导致农药的使用频率和使用量不断加大，出现了用药量与病虫害相互递增的恶性循环，最后造成农产品中化学农药的残留量增加，对人、畜的健康安全造成了极大的威胁。一系列严重的问题促使人们开发一种对人类和环境友好型、具有良好防治效果的新的植物病虫害防治策略。
随着人们对食品安全的日益重视，可持续控制病虫害发展的需要，生物防治受到了各国政府和植物保护专家的重视。生物防治是指用生物代谢产物来控制病虫害的一项技术，是综合防治体系中一个必不可缺少的组成部分[1]。由于生物防治主要是运用自然界生物相生相克的原理，人为地增多在自然界中存在的对病虫害有相克作用的生物，来控制有害生物的危害，故避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境和能源方面的问题，避免了农药残留对人畜的危害，更重要的是生物防治促进了环境生态平衡，促进了农业的可持续发展，是一种环境友好的植保技术。近年来随着分子生物学技术、细胞工程、蛋白质工程、酶工程、发酵工程、基因工程等新技术的飞速发展，生物农药产生了巨大的社会和经济效益，表现出良好的应用前景。目前应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp. )、土壤放射杆菌(Agrobacterium radiobacter)等[2]。
枯草芽孢杆菌（Bacillus spp.）是目前生防细菌中研究较多的一类，广泛分布于各种不同生态环境中的革兰氏阳性细菌，呈杆状，在土壤和植物的表面普遍存在[3]。因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，对人和动物无毒害作用，不污染环境，同时，生长速度快，营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖与繁殖，是一种理想的生防微生物[4]。
枯草芽孢杆菌（B.subtilis）为革兰氏阳性菌，一直作为模式种来研究细菌的生长及孢子的形成过程。后来研究发现野生型B.subtulis菌株能在实验室条件中形成生物膜，也能在植物的根围形成致密的生物膜，保护植物不受植物病原细菌和真菌的侵染，对植物防御病原菌侵染有着重要的意义[5]。
相比生物膜形成能力较弱的菌株，生物膜形成能力更强的野生型枯草芽孢杆菌具有更好的生防效果。并且自然界土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌菌株都能形成粗糙的生物膜，而实验室驯化的菌株却不能形成生物膜，可以推测生物膜对枯草芽孢杆菌在自然界的适应生存能力有着重要作用[6]。通过进一步的实验探究得出生物膜增强突变体，防治效果增强，减弱突变体，生防活性也降低，因此可以推论枯草芽孢杆菌生物膜形成能力与防病效果呈正相关[7]。
comER是吡咯啉5羧酸酯还原酶，涉及到脯氨酸生物合成代谢最后一步[8]，根据在基因组中的位置以及在蛋白功能预测comER属于诱导感受态形成晚期过程中的基因。根据相关研究表明，在LBGM培养基中，培养48h后，野生型菌株已经形成明显的生物膜表征，而comER突变体则仅仅形成部分薄薄的没有明显特征的膜状片状物[9]。该结果表明comER可以调控生物膜形成，在枯草芽孢杆菌生物膜形成中具有重要作用。并且已有研究验证，在枯草芽孢杆菌中，comER的缺失并不会造成生长受限，进一步表明comER突变体生物膜形成能力的缺陷并不是生长受限引起的。
综上所述，可以推测枯草芽孢杆菌生物膜与生物防治存在正相关性，comER基因可以调控枯草芽孢杆菌生物膜形成，在生物膜形成中发挥重要作用。故comER基因的研究在枯草芽孢杆菌生防能力方面显得尤为重要。
1 材料与方法
1.1 菌株及培养条件
本研究中所选用的菌株为：枯草芽孢杆菌SM21和3610；解淀粉芽孢杆菌54。主要来源见表1。使用的培养基主要为：细菌生长常规培养基LB、 枯草芽孢杆菌转化培养基MC，培养温度为37℃，培养基配方如下：
LB（1 L）：10 g 蛋白胨，5 g 酵母粉，5 g 氯化钠；
MC（10 X ）：14.036 g/L K2HPO43H2O，5.239 g KH2PO4，20 g 葡萄糖，1 g casein，2g谷氨酸钾盐，1 ml 300 mM 柠檬酸三钠，1 ml 22 mg/ml 柠檬酸铁胺；
需使用的抗生素及相应终浓度为： 100 ugml1壮观霉素（Spectinomycin）、20ugml1卡那霉素（Kanamycin）、5ugml1氯霉素(Chloramphenicol)、100ugml1氨苄(Ampicillin)。
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