苯噻菌酯与咯菌腈氟啶胺复配防治灰霉病的研究
摘要：离体条件下采用菌丝生长速率法测定了苯噻菌酯与咯菌腈、氟啶胺分别以不同配比二元混配对灰葡萄孢菌的增效系数（SR值），旨在筛选出防治灰霉病的有效配方。结果表明：苯噻菌酯、咯菌腈、氟啶胺及各混配试样对灰葡萄孢菌的菌丝生长均表现优异抑菌活性。当苯噻菌酯与咯菌腈混配比例在1:1~6:1时均表现出增效作用，SR值为1.5107~3.1649，以1:1复配时增效作用最显著；苯噻菌酯和氟啶胺比例在1:1~1:6和2:1时表现出增效作用，SR值为1.6273~2.50861，以1:4复配时增效作用最显著。盆栽实验结果表明：这3种单剂和2种复配剂（以最佳配比混配）对灰霉病都有很好的防治效果，而且复配剂对灰霉病的防治效果优于同剂量的各单剂防效，所筛选的两种复配剂在25 μg/mL时防效均达到100 %。另外，筛选出的2个配方对灰葡萄孢菌多抗菌株(同时对多菌灵、腐霉利、乙霉威、嘧霉胺、嘧菌酯和/或苯噻菌酯产生抗药性)也具有很好的抑制活性。因此，本文提供的这2种复配剂对于灰霉病多药抗药性的治理具有重要意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1供试菌株 2
1.2 供试黄瓜品种3
1.3供试药剂与培养基3
苯噻菌酯与咯菌腈以不同配比混配对灰葡萄孢菌的抑制活性3
1.4 苯噻菌酯与氟啶胺以不同配比混配对灰葡萄孢菌的抑制活性 4
1.5 联合作用评价 4 1.6 两种复配剂（以最佳配比混配）对灰葡萄孢菌多抗菌株的抑制活性 4
1.7 两种复配剂（以最佳配比混配）对灰葡萄孢菌的盆栽药效试验测定 5
2 结果与分析5
2.1 苯噻菌酯与咯菌腈以不同配比混配对灰葡萄孢菌的抑制活性 5
苯噻菌酯与氟啶胺以不同配比混配对灰葡萄孢菌的抑制活性 6
2.3两种复配剂（以最佳配比混配）对灰葡萄孢菌多抗菌株的抑制活性 7
2.4 两种复配剂（以最佳配比混配）对灰葡萄孢菌的盆栽药效试验测定 7
3 讨论9
致谢9
参考文献10
表1 苯
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
噻菌酯与咯菌腈混配比例及浓度设置3
表2 苯噻菌酯与咯菌腈混配比例及浓度设置4
表3 苯噻菌酯和咯菌腈的不同比例复配剂对灰葡萄孢菌的毒力6
表4苯噻菌酯和氟啶胺的不同比例复配剂对灰葡萄孢菌的毒力6
表5 2种复配剂对灰葡萄孢菌多抗菌株的毒力7
表6盆栽试验测定2种复配剂对灰葡萄孢菌的防治效果8
苯噻菌酯与咯菌腈、氟啶胺复配防治灰霉病的研究
引言
灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers. ex Fr.)引起的一种世界性病害，是当前设施作物生产中的重要病害之一，在番茄、黄瓜、草莓上的危害尤为严重，一般造成减产20～40％，严重时可达60％以上[13]。目前，生产上常用来防治灰霉病的几类杀菌剂均因灰葡萄孢菌抗药性的产生导致防治效果降低[47]，因此，亟待开发高效新型杀菌剂及复配剂，对治理灰葡萄孢菌的抗药性及有效控制灰霉病危害具有重要的意义。
苯噻菌酯（benzothiostrobin）是由华中师范大学杨光富教授课题组研发成功的一种新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，已有研究表明：在离体及活体条件下，苯噻菌酯对灰葡萄孢菌均具有优异的抑菌活性。但是，潜在抗性风险评估结果表明，灰葡萄孢菌对苯噻菌酯具有较高的抗性风险，因此，有必要将苯噻菌酯与其它作用机制的杀菌剂轮换或混合使用来有效控制灰霉病，降低抗药性风险。
咯菌腈（fludioxonil）是先正达公司开发的吡咯类非内吸性杀菌剂，具有低毒、高效等特点[8]。咯菌腈对防治灰霉病有特效[9]，在我国刚开始应用。本实验室课题组首次在山东部分地区发现抗性菌株，且大部分抗性水平低，1 μg/mL的咯菌即可完全抑制低抗菌株的生长。仅发现少数田间高抗菌株，而且这些高抗菌株的生物适合度很低，在自然环境中的生存竞争能力弱。所以，咯菌腈目前仍是防治灰霉病的有效药剂，但是田间抗性菌株的出现是一个预警，应减少该药剂的选择压力，将咯菌腈与它杀菌剂轮换或混配使用，以延缓抗药性的发展。
氟啶胺(fluazinam) 是由日本石原公司研制的一种二硝基苯胺类保护性杀菌剂,杀菌谱广、持效期长[10]。该药剂是抑制病菌呼吸作用的线粒体氧化磷酸化解偶联剂,可抑制孢子萌发、菌丝生长和孢子形成等病菌所有阶段的感染过程[1113]。陈志芳等研究表明氟啶胺与其它类杀菌剂没有交互抗性，对灰葡萄孢菌多抗菌株的防效甚好[14]。目前，国内尚无氟啶胺田间抗性的报道，也是防治灰霉病的有效药剂之一。
前期研究表明：苯噻菌酯与咯菌腈、氟啶胺之间均不存在交互抗性，为了延长现有防治灰霉病有效药剂的使用寿命，本文通过测定不同配比的苯噻菌酯与咯菌腈、苯噻菌酯与氟啶胺对灰葡萄孢菌的联合毒力，旨在筛选出最佳增效配比的配方，然后进行温室试验，验证复配剂的防效，为进一步研发灰霉病的防治及抗性治理药剂奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株
野生敏感灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）单孢菌株Bc1和多抗菌株Nj48（抗多菌灵、腐霉利、乙霉威、嘧霉胺和嘧菌酯）由本实验室分离、保存。
1. 2 供试黄瓜品种
盆栽试验黄瓜品种为密刺，购买于种子门市部。
1. 3 供试药剂与培养基
97 %苯噻菌酯原药（benzothiostrobin，由华中师范大学杨光富教授惠赠），99 %水杨肟酸（SHAM，由Sigma公司提供），97.5%氟啶胺原药（fluazinam，由江苏江阴化工有限公司提供）和97.9 %咯菌腈原药（fludioxonil，由江苏省扬农化工有限公司提供），上述杀菌剂分别预溶于甲醇配制成50 mg/mL的母液，备用。
50 %咯菌腈可湿性粉剂由先正达（苏州）作物保护有限公司提供，50 %氟啶胺悬浮剂由日本石原产业株式会社提供。
AEA培养基：酵母提取物5 g，NaNO3 6 g，KCl 0.5 g，KH2PO4 1.5 g，MgSO4 0.25 g，甘油20 mL，琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L，经高压高温灭菌后，常温保存。
1. 4 苯噻菌酯与咯菌腈以不同配比混配对灰葡萄孢菌的抑制活性
参照菌丝生长速率法，在AEA平板上培养3 d的菌株Bc1菌落边缘打取新鲜菌碟（直径5mm）分别接于含有苯噻菌酯一系列浓度的AEA或含有咯菌腈一系列浓度的AEA平板上，同时也接入含有苯噻菌酯和咯菌腈以一系列不同比例混合的AEA平板上（注意各处理均预先加入终浓度为50 μg/mL的SHAM来抑制旁路氧化途径），混配比例及药剂浓度设置见表1。每个处理重复4皿，25℃培养3 d后采用十字交叉法测量菌落直径，计算出菌丝生长抑制率。应用DPS软件，根据药剂浓度的对数值和抑制率的几率值之间的线性回归分析，计算出毒力回归方程Y=a+bX、EC50、相关系数r及95%置信区间。本试验重复3次。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1供试菌株 2
1.2 供试黄瓜品种3
1.3供试药剂与培养基3
苯噻菌酯与咯菌腈以不同配比混配对灰葡萄孢菌的抑制活性3
1.4 苯噻菌酯与氟啶胺以不同配比混配对灰葡萄孢菌的抑制活性 4
1.5 联合作用评价 4 1.6 两种复配剂（以最佳配比混配）对灰葡萄孢菌多抗菌株的抑制活性 4
1.7 两种复配剂（以最佳配比混配）对灰葡萄孢菌的盆栽药效试验测定 5
2 结果与分析5
2.1 苯噻菌酯与咯菌腈以不同配比混配对灰葡萄孢菌的抑制活性 5
苯噻菌酯与氟啶胺以不同配比混配对灰葡萄孢菌的抑制活性 6
2.3两种复配剂（以最佳配比混配）对灰葡萄孢菌多抗菌株的抑制活性 7
2.4 两种复配剂（以最佳配比混配）对灰葡萄孢菌的盆栽药效试验测定 7
3 讨论9
致谢9
参考文献10
表1 苯
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
噻菌酯与咯菌腈混配比例及浓度设置3
表2 苯噻菌酯与咯菌腈混配比例及浓度设置4
表3 苯噻菌酯和咯菌腈的不同比例复配剂对灰葡萄孢菌的毒力6
表4苯噻菌酯和氟啶胺的不同比例复配剂对灰葡萄孢菌的毒力6
表5 2种复配剂对灰葡萄孢菌多抗菌株的毒力7
表6盆栽试验测定2种复配剂对灰葡萄孢菌的防治效果8
苯噻菌酯与咯菌腈、氟啶胺复配防治灰霉病的研究
引言
灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers. ex Fr.)引起的一种世界性病害，是当前设施作物生产中的重要病害之一，在番茄、黄瓜、草莓上的危害尤为严重，一般造成减产20～40％，严重时可达60％以上[13]。目前，生产上常用来防治灰霉病的几类杀菌剂均因灰葡萄孢菌抗药性的产生导致防治效果降低[47]，因此，亟待开发高效新型杀菌剂及复配剂，对治理灰葡萄孢菌的抗药性及有效控制灰霉病危害具有重要的意义。
苯噻菌酯（benzothiostrobin）是由华中师范大学杨光富教授课题组研发成功的一种新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，已有研究表明：在离体及活体条件下，苯噻菌酯对灰葡萄孢菌均具有优异的抑菌活性。但是，潜在抗性风险评估结果表明，灰葡萄孢菌对苯噻菌酯具有较高的抗性风险，因此，有必要将苯噻菌酯与其它作用机制的杀菌剂轮换或混合使用来有效控制灰霉病，降低抗药性风险。
咯菌腈（fludioxonil）是先正达公司开发的吡咯类非内吸性杀菌剂，具有低毒、高效等特点[8]。咯菌腈对防治灰霉病有特效[9]，在我国刚开始应用。本实验室课题组首次在山东部分地区发现抗性菌株，且大部分抗性水平低，1 μg/mL的咯菌即可完全抑制低抗菌株的生长。仅发现少数田间高抗菌株，而且这些高抗菌株的生物适合度很低，在自然环境中的生存竞争能力弱。所以，咯菌腈目前仍是防治灰霉病的有效药剂，但是田间抗性菌株的出现是一个预警，应减少该药剂的选择压力，将咯菌腈与它杀菌剂轮换或混配使用，以延缓抗药性的发展。
氟啶胺(fluazinam) 是由日本石原公司研制的一种二硝基苯胺类保护性杀菌剂,杀菌谱广、持效期长[10]。该药剂是抑制病菌呼吸作用的线粒体氧化磷酸化解偶联剂,可抑制孢子萌发、菌丝生长和孢子形成等病菌所有阶段的感染过程[1113]。陈志芳等研究表明氟啶胺与其它类杀菌剂没有交互抗性，对灰葡萄孢菌多抗菌株的防效甚好[14]。目前，国内尚无氟啶胺田间抗性的报道，也是防治灰霉病的有效药剂之一。
前期研究表明：苯噻菌酯与咯菌腈、氟啶胺之间均不存在交互抗性，为了延长现有防治灰霉病有效药剂的使用寿命，本文通过测定不同配比的苯噻菌酯与咯菌腈、苯噻菌酯与氟啶胺对灰葡萄孢菌的联合毒力，旨在筛选出最佳增效配比的配方，然后进行温室试验，验证复配剂的防效，为进一步研发灰霉病的防治及抗性治理药剂奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株
野生敏感灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）单孢菌株Bc1和多抗菌株Nj48（抗多菌灵、腐霉利、乙霉威、嘧霉胺和嘧菌酯）由本实验室分离、保存。
1. 2 供试黄瓜品种
盆栽试验黄瓜品种为密刺，购买于种子门市部。
1. 3 供试药剂与培养基
97 %苯噻菌酯原药（benzothiostrobin，由华中师范大学杨光富教授惠赠），99 %水杨肟酸（SHAM，由Sigma公司提供），97.5%氟啶胺原药（fluazinam，由江苏江阴化工有限公司提供）和97.9 %咯菌腈原药（fludioxonil，由江苏省扬农化工有限公司提供），上述杀菌剂分别预溶于甲醇配制成50 mg/mL的母液，备用。
50 %咯菌腈可湿性粉剂由先正达（苏州）作物保护有限公司提供，50 %氟啶胺悬浮剂由日本石原产业株式会社提供。
AEA培养基：酵母提取物5 g，NaNO3 6 g，KCl 0.5 g，KH2PO4 1.5 g，MgSO4 0.25 g，甘油20 mL，琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L，经高压高温灭菌后，常温保存。
1. 4 苯噻菌酯与咯菌腈以不同配比混配对灰葡萄孢菌的抑制活性
参照菌丝生长速率法，在AEA平板上培养3 d的菌株Bc1菌落边缘打取新鲜菌碟（直径5mm）分别接于含有苯噻菌酯一系列浓度的AEA或含有咯菌腈一系列浓度的AEA平板上，同时也接入含有苯噻菌酯和咯菌腈以一系列不同比例混合的AEA平板上（注意各处理均预先加入终浓度为50 μg/mL的SHAM来抑制旁路氧化途径），混配比例及药剂浓度设置见表1。每个处理重复4皿，25℃培养3 d后采用十字交叉法测量菌落直径，计算出菌丝生长抑制率。应用DPS软件，根据药剂浓度的对数值和抑制率的几率值之间的线性回归分析，计算出毒力回归方程Y=a+bX、EC50、相关系数r及95%置信区间。本试验重复3次。
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