本科生毕业论文甲烷菌MethanobrevibacterthaueriF1对厌氧真菌Piromycessp.F1代谢产物
本科生毕业论文甲烷菌MethanobrevibacterthaueriF1对厌氧真菌Piromycessp.F1代谢产物的影响姓名游思佩学院动物科技学院专业动物科学班级动科102学号15110226指导教师金巍职称讲师2014年5月13日[20200510204505]
摘要：为研究共生条件下甲烷菌Methanobrevibacter thaueri F1对厌氧真菌Piromyces sp. F1代谢产物的影响，本文对厌氧真菌纯培养物及其与甲烷菌的共培养物进行了体外厌氧发酵并利用气相色谱和高效液相色谱法监测了发酵过程中厌氧真菌和甲烷菌的代谢产物变化情况。结果显示，厌氧真菌和甲烷菌共培养组的累计产气量 ( 144.7 ml ) 显著高于厌氧真菌纯培养组 ( 120.3 ml ) ( P<0.01 )。共培养组发酵液中的甲酸含量在30 h前与纯培养组差异不显著( P>0.01 )，从48 h开始共培养组发酵液中甲酸含量迅速降低，而纯培养组甲酸不断积累。纯培养组发酵液中的乳酸和乙醇含量始终高于共培养组，且分别在60 h和30 h后与纯培养组差异显著 ( P<0.01 )，而共培养组的乙酸含量始终高于纯培养组 ( P<0.01 )。结论：共培养条件下，甲烷菌促使厌氧真菌产生更多的乙酸。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:厌氧真菌；甲烷菌；共培养物；代谢产物
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 2
1材料和方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 培养基成分及其配置 2
1.1.2 菌种来源 2
1.2 方法 2
1.2.1 发酵试验设计 2
1.2.2 甲烷测定 2
1.2.3 总产气量的测定 2
1.2.4 高效液相色谱测定有机酸 2
1.3 主要试剂和仪器 2
1.4 数据处理.......................................................................................................................2
2结果分析 3
2.1厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96小时 pH值的动态变化 3
2.2 厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96 h累积产气量的动态变化 3
2.3厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96 h 甲烷产量的动态变化 4
2.4共培养组与纯培养组发酵96 h 过程中甲酸、乙酸和乳酸的发酵变化规律 5
3讨论..........................................................................................................................................7
致谢....... *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
......................................................................................................................................8
参考文献 9
甲烷菌Methanobrevibacter thaueri F1对厌氧真菌Piromyces sp. F1代谢产物的影响
动物科学 游思佩
引言
引言
瘤胃是一个复杂的生态系统，里面栖居着大量的目前还不被人们完全了解的厌氧真菌、古菌、原虫和细菌。这些微生物在瘤胃内的能量转化过程中起着重要的作用。厌氧真菌和甲烷菌之间的种间氢转移，使这两种微生物紧密联系在一起。目前已知甲烷菌与厌氧真菌体外共培养不仅可以提高厌氧真菌胞外水解酶的活性，提高底物的降解和利用效率，还能够影响厌氧真菌的代谢途径，改变最终的代谢产物（Bauchop等，1981； Teunissen等，1992 ；Nakashimada等，2000； Cheng等，2009，Jin等，2011）。有研究报道，甲烷菌能够利用厌氧真菌的代谢产物，使培养基中仅存少量的H2，CO2 和甲酸，而乙酸是否大量积累与甲烷菌的种类相关，并且不同底物对厌氧真菌的代谢产物也有影响（Mountfort等，1982；Lowe等，1987）。然而，这些研究多集中于将厌氧真菌纯菌株与甲烷菌纯菌株人为组合成共培养物。因为这些共培养物不是自然组合，因此这些研究将无法反映瘤胃中厌氧真菌与甲烷菌的真实互作关系，而对有关厌氧真菌和甲烷菌针对葡萄糖的基础代谢的相互作用机制，尤其是纯培养与共培养情况下厌氧真菌的动态代谢变化则鲜有报道。
为了了解在以葡萄糖为底物的条件下，甲烷菌对厌氧真菌的代谢产物的影响，本文利用气相色谱和高效液相色谱对前期分离得到的瘤胃厌氧真菌与甲烷菌的自然组合 ( Piromyces sp. F1 + Methanobrevibacter sp. F1 )的代谢产物进行了研究。
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1 培养基成分及其配置
本实验所用完全培养基参照Barichevich ( 1990 )的方法配制。以20 mmol的葡萄糖作为底物。
1.1.2 菌种来源
实验菌种采用本实验室从本地山羊瘤胃液中分离得到的厌氧真菌和甲烷菌的共培养物F1。其中，厌氧真菌为Piromyces sp. F1，甲烷菌为Methanobrevibacter thaueri F1( 金巍，2009 ) 。实验前将菌种复活后纯化3-4次，确保活性及纯度。
1.2 方法
1.2.1 发酵试验设计
试验分为厌氧真菌与甲烷菌共培养物组 ( F1B) 和通过添加氯霉素去除甲烷菌的厌氧真菌纯培养组 ( F1A ) 。试验按照发酵产气量分为12个采样点。每个组设3个重复并设空白对照。接种结束后，用气压转换仪 ( IGER，UK ) 平衡发酵瓶内气压，使初始气压为零。分别于不同时间点测定产气量和甲烷产量。并在相应时间点发酵结束后立即测定pH值，并取上清液-20℃保存，以备测有机酸等指标。
1.2.2 甲烷测定 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
/> 甲烷的测定采用气相色谱法。仪器及相关参数如下：GC-14B型气相色谱仪（日本岛津），毛细管柱，柱温80 ℃，汽化室100 ℃，氢离子火焰检测器，检测温度120 ℃，载气为氮气，压力为0.05 MPa，氢气压力为0.05 MPa，氧气压力0.05 MPa。
1.2.3 总产气量的测定
总产气量的测定参照 Theodorou 等 ( 1995 ) 的方法，于0 h、6h、12 h、18h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h、78h、84 h、90h、96 h测定发酵瓶内产气量。注意全程无菌操作，对气压转换器的针头和操作桌面用75%的酒精消毒，并对每组发酵瓶瓶盖使用用75%的酒精消毒。将各时间点的产气量相加得到累计产气量。
1.2.4 高效液相色谱测定有机酸
于0 h、12 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、72 h、84 h、96 h、12个时间点对平行组进行采样。取10000转离心5分钟后的上清液保存 -20℃备测。主要测定指标包括甲酸，乙酸，乳酸。
1.3 主要试剂和仪器
气相色谱仪、液相色谱仪、珠磨仪、隔水式恒温培养箱、厌氧分装系统、青链霉素粉剂。
1.4 数据处理
数据经Excel 2007 初步处理后，利用SPSS(16.0) one-way ANOVA中的Duncan法进行统计分析，置信区间为95%。数据以三个重复的平均值±标准误的形式表示。
2结果分析
2.1厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96小时 pH值的动态变化
共培养组和纯培养组的pH值随时间变化的情况如图1所示。结果显示，随着发酵的进行，纯培养组的pH值的变化总体呈降低趋势，变化范围从6.1到6.56。在发酵进行24 h -48 h过程中，纯培养组pH值显著高于共培养组 ( P<0.05 )，但当发酵54 h时，纯培养组pH值迅速降低，达到最低值6.11，且显著低于共培养组，随后pH值虽略有升高，但pH值始终显著低于共培养组 ( P<0.05 )，并在60 h后基本不变。共培养组虽然也在54 h时pH值达到最低，但仍显著高于纯培养组 ( P<0.05 )。发酵60 h后，共培养组和纯培养组的变化趋势基本一致，即pH值逐渐趋于稳定。在发酵96 h结束时，纯培养的pH值显著低于共培养组 ( P<0.05 )。
摘要：为研究共生条件下甲烷菌Methanobrevibacter thaueri F1对厌氧真菌Piromyces sp. F1代谢产物的影响，本文对厌氧真菌纯培养物及其与甲烷菌的共培养物进行了体外厌氧发酵并利用气相色谱和高效液相色谱法监测了发酵过程中厌氧真菌和甲烷菌的代谢产物变化情况。结果显示，厌氧真菌和甲烷菌共培养组的累计产气量 ( 144.7 ml ) 显著高于厌氧真菌纯培养组 ( 120.3 ml ) ( P<0.01 )。共培养组发酵液中的甲酸含量在30 h前与纯培养组差异不显著( P>0.01 )，从48 h开始共培养组发酵液中甲酸含量迅速降低，而纯培养组甲酸不断积累。纯培养组发酵液中的乳酸和乙醇含量始终高于共培养组，且分别在60 h和30 h后与纯培养组差异显著 ( P<0.01 )，而共培养组的乙酸含量始终高于纯培养组 ( P<0.01 )。结论：共培养条件下，甲烷菌促使厌氧真菌产生更多的乙酸。
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关键字:厌氧真菌；甲烷菌；共培养物；代谢产物
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关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 2
1材料和方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 培养基成分及其配置 2
1.1.2 菌种来源 2
1.2 方法 2
1.2.1 发酵试验设计 2
1.2.2 甲烷测定 2
1.2.3 总产气量的测定 2
1.2.4 高效液相色谱测定有机酸 2
1.3 主要试剂和仪器 2
1.4 数据处理.......................................................................................................................2
2结果分析 3
2.1厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96小时 pH值的动态变化 3
2.2 厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96 h累积产气量的动态变化 3
2.3厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96 h 甲烷产量的动态变化 4
2.4共培养组与纯培养组发酵96 h 过程中甲酸、乙酸和乳酸的发酵变化规律 5
3讨论..........................................................................................................................................7
致谢....... *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
......................................................................................................................................8
参考文献 9
甲烷菌Methanobrevibacter thaueri F1对厌氧真菌Piromyces sp. F1代谢产物的影响
动物科学 游思佩
引言
引言
瘤胃是一个复杂的生态系统，里面栖居着大量的目前还不被人们完全了解的厌氧真菌、古菌、原虫和细菌。这些微生物在瘤胃内的能量转化过程中起着重要的作用。厌氧真菌和甲烷菌之间的种间氢转移，使这两种微生物紧密联系在一起。目前已知甲烷菌与厌氧真菌体外共培养不仅可以提高厌氧真菌胞外水解酶的活性，提高底物的降解和利用效率，还能够影响厌氧真菌的代谢途径，改变最终的代谢产物（Bauchop等，1981； Teunissen等，1992 ；Nakashimada等，2000； Cheng等，2009，Jin等，2011）。有研究报道，甲烷菌能够利用厌氧真菌的代谢产物，使培养基中仅存少量的H2，CO2 和甲酸，而乙酸是否大量积累与甲烷菌的种类相关，并且不同底物对厌氧真菌的代谢产物也有影响（Mountfort等，1982；Lowe等，1987）。然而，这些研究多集中于将厌氧真菌纯菌株与甲烷菌纯菌株人为组合成共培养物。因为这些共培养物不是自然组合，因此这些研究将无法反映瘤胃中厌氧真菌与甲烷菌的真实互作关系，而对有关厌氧真菌和甲烷菌针对葡萄糖的基础代谢的相互作用机制，尤其是纯培养与共培养情况下厌氧真菌的动态代谢变化则鲜有报道。
为了了解在以葡萄糖为底物的条件下，甲烷菌对厌氧真菌的代谢产物的影响，本文利用气相色谱和高效液相色谱对前期分离得到的瘤胃厌氧真菌与甲烷菌的自然组合 ( Piromyces sp. F1 + Methanobrevibacter sp. F1 )的代谢产物进行了研究。
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1 培养基成分及其配置
本实验所用完全培养基参照Barichevich ( 1990 )的方法配制。以20 mmol的葡萄糖作为底物。
1.1.2 菌种来源
实验菌种采用本实验室从本地山羊瘤胃液中分离得到的厌氧真菌和甲烷菌的共培养物F1。其中，厌氧真菌为Piromyces sp. F1，甲烷菌为Methanobrevibacter thaueri F1( 金巍，2009 ) 。实验前将菌种复活后纯化3-4次，确保活性及纯度。
1.2 方法
1.2.1 发酵试验设计
试验分为厌氧真菌与甲烷菌共培养物组 ( F1B) 和通过添加氯霉素去除甲烷菌的厌氧真菌纯培养组 ( F1A ) 。试验按照发酵产气量分为12个采样点。每个组设3个重复并设空白对照。接种结束后，用气压转换仪 ( IGER，UK ) 平衡发酵瓶内气压，使初始气压为零。分别于不同时间点测定产气量和甲烷产量。并在相应时间点发酵结束后立即测定pH值，并取上清液-20℃保存，以备测有机酸等指标。
1.2.2 甲烷测定
/> 甲烷的测定采用气相色谱法。仪器及相关参数如下：GC-14B型气相色谱仪（日本岛津），毛细管柱，柱温80 ℃，汽化室100 ℃，氢离子火焰检测器，检测温度120 ℃，载气为氮气，压力为0.05 MPa，氢气压力为0.05 MPa，氧气压力0.05 MPa。
1.2.3 总产气量的测定
总产气量的测定参照 Theodorou 等 ( 1995 ) 的方法，于0 h、6h、12 h、18h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h、78h、84 h、90h、96 h测定发酵瓶内产气量。注意全程无菌操作，对气压转换器的针头和操作桌面用75%的酒精消毒，并对每组发酵瓶瓶盖使用用75%的酒精消毒。将各时间点的产气量相加得到累计产气量。
1.2.4 高效液相色谱测定有机酸
于0 h、12 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、72 h、84 h、96 h、12个时间点对平行组进行采样。取10000转离心5分钟后的上清液保存 -20℃备测。主要测定指标包括甲酸，乙酸，乳酸。
1.3 主要试剂和仪器
气相色谱仪、液相色谱仪、珠磨仪、隔水式恒温培养箱、厌氧分装系统、青链霉素粉剂。
1.4 数据处理
数据经Excel 2007 初步处理后，利用SPSS(16.0) one-way ANOVA中的Duncan法进行统计分析，置信区间为95%。数据以三个重复的平均值±标准误的形式表示。
2结果分析
2.1厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96小时 pH值的动态变化
共培养组和纯培养组的pH值随时间变化的情况如图1所示。结果显示，随着发酵的进行，纯培养组的pH值的变化总体呈降低趋势，变化范围从6.1到6.56。在发酵进行24 h -48 h过程中，纯培养组pH值显著高于共培养组 ( P<0.05 )，但当发酵54 h时，纯培养组pH值迅速降低，达到最低值6.11，且显著低于共培养组，随后pH值虽略有升高，但pH值始终显著低于共培养组 ( P<0.05 )，并在60 h后基本不变。共培养组虽然也在54 h时pH值达到最低，但仍显著高于纯培养组 ( P<0.05 )。发酵60 h后，共培养组和纯培养组的变化趋势基本一致，即pH值逐渐趋于稳定。在发酵96 h结束时，纯培养的pH值显著低于共培养组 ( P<0.05 )。
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