某渔场嗜水气单胞菌的分离鉴定及特性分析
气单胞菌广泛分布于各种水体环境中，是导致淡水鱼败血症的主要病原，对水产养殖业造成巨大的经济损失。为了了解嗜水气单胞菌的感染情况，本试验从南京地区的渔场及水样中采集样品，通过细菌分离纯化和特异性gyrB基因扩增测序方法进行细菌鉴定，结果分离到10株气单胞菌，其中2株为嗜水气单胞菌。生物学特性分析显示这两株嗜水气单胞菌具有较强的溶血性和生物被膜形成能力，对斑马鱼的半数致死量分别为2.4 × 103 CFU /尾和1.4 × 103 CFU /尾，显示出较强的致病性。本研究对于进一步预防和控制嗜水气单胞菌相关疾病的发生和传播具有重要意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 样品采集与参考菌株 2
1.1.2 仪器和试剂 2
1.2 方法 2
1.2.1 细菌的分离培养与纯化 2
1.2.2 细菌溶血性的观察 2
1.2.3 分离菌株的分子鉴定 2
1.2.4 嗜水气单胞菌生长曲线的测定 3
1.2.5 嗜水气单胞菌生物被膜形成能力的测定 3
1.2.6 嗜水气单胞菌游动能力的测定 3
1.2.7 嗜水气单胞菌群集运动能力的测定 4
1.2.8 嗜水气单胞菌斑马鱼致病性实验 4
2 结果与分析 4
2.1细菌的分离鉴定 4
2.2 细菌溶血性的观察 4
2.3 分离菌株的分子鉴定 5
2.4 嗜水气单胞菌生长曲线的测定 5
2.5 嗜水气单胞菌生物被膜形成能力的测定 6
2.6 嗜水气单胞菌游动能力的测定 6
2.7嗜水气单胞菌群集运动能力的测定 7
2.8 嗜水气单胞菌斑马鱼致病性实验 8
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
南京某渔场嗜水气单胞菌的分离鉴定及特性分析
引言
气单胞菌属（Aeromonas）在 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
细菌分类学上属于气单胞菌科（Aeromonadaceae）,革兰阴性杆菌，广泛分布于各种水体环境中，在应激条件下能引起鱼类爆发出血性败血症[1, 2]，是水生动物尤其是鱼类最常见的致病菌，严重威胁渔业养殖。此外，气单胞菌是一种重要的人兽鱼共患的病原菌，还能够感染包括冷血动物在内的多种动物如禽类及哺乳类，引起败血症或皮肤溃疡等局部感染；并且能够严重威胁人体健康，引起各种肠道外和全身性感染以及胃肠道感染[3, 4]。
嗜水气单胞菌（ Aeromonas hydrophila）是一种运动性气单胞菌，是导致运动性气单胞菌败血症（MAS）的主要病原菌。1990年前后，我国淡水养殖鱼类曾经大面积暴发“细菌性败血症”，主要病原就是嗜水气单胞菌。近些年由嗜水气单胞菌引起的食物中毒、水源性肠道传染病、感染性腹泻也时有发生[5]；并且由于目前药物的不合理使用，使得对于嗜水气单胞菌病的防控难度越来越大[6, 7]。
为了解南京地区渔业生产中气单胞菌的感染情况，本试验从南京某渔场的病鱼蟹及水样中进行了气单胞菌的分离纯化培养，通过gyrB基因扩增测序方法进行菌种鉴定，并对嗜水气单胞菌进行了致病性检测，为有效预防和控制嗜水气单胞菌相关疾病的发生和传播提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集与参考菌株
本实验先后采集样品4次共分离得到12株细菌，其中1株菌分离自池塘水，7株菌分离自病鱼，4株菌分离自病蟹。参考菌株NJ35，为2010年于南京禄口分离到的一株强毒株，经16sRNA和gyrB基因测序鉴定为嗜水气单胞菌，大学兽医微生物学实验室保存有此菌株。
1.1.2 仪器和试剂
LB培养基：1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物。
血琼脂平板培养基：1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物，1.5％琼脂粉，
5％脱纤维绵羊血。
试剂：2×PCR PreMix南京诺唯赞生物科技有限公司，绵羊脱纤维红细胞购自南京鼎国生物科技有限公司，无菌PBS缓冲液（NaCl 137 mM/L，KCl 2.7 mM /L，Na2HPO4 10 mM /L，KH2PO4 2 mM /L）。
相关仪器：大型台式冷冻离心机（Heraeus），微型离心机（Eppendorf）， PCR仪（Eppendorf）、凝胶成像系统（BioRad）、紫外分光光度计（BioRad）、多功能酶标仪（MultiskanGO，Thermo Scientific）、核酸凝胶电泳仪（南京科宝仪器研究所）。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离培养与纯化
水样：用接种环蘸取水样在普通LB固体培养基上四区划线接种，28℃温箱培养24h。
病鱼：将病鱼洗净后，并用酒精棉进行消毒，在超净台里用灭菌过的手术器械将鱼剖开，取鳃、肾与肝剪开一横截面后涂抹在LB固体培养基上，后用接种环四区划线，28℃温箱培养24h。
病蟹：将病蟹洗净后，在超净台里从背部轻轻把壳敲碎，将碎片用镊子移取，避免损伤内脏，后用灭菌后的镊子取蟹心与肝胰腺（蟹黄）涂抹于LB固体培养基中，再用接种环四区划线接种，28℃温箱培养24h。
培养后，从各个平板上挑取表面光滑湿润、微凸、边缘整齐、白色或淡黄色单菌落转移至LB液体培养基中，28℃培养过夜。经过再一次划线纯化，挑取单菌落，并进行革兰染色，将镜检为革兰阴性短杆菌的菌液保存备用。
1.2.2 细菌溶血性的观察
将分离细菌纯培养物转接至LB液体培养基中，28℃、180 rpm培养46h，取10 μL菌液滴于血平板上，28℃温箱培养24 h，观察溶血环。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 样品采集与参考菌株 2
1.1.2 仪器和试剂 2
1.2 方法 2
1.2.1 细菌的分离培养与纯化 2
1.2.2 细菌溶血性的观察 2
1.2.3 分离菌株的分子鉴定 2
1.2.4 嗜水气单胞菌生长曲线的测定 3
1.2.5 嗜水气单胞菌生物被膜形成能力的测定 3
1.2.6 嗜水气单胞菌游动能力的测定 3
1.2.7 嗜水气单胞菌群集运动能力的测定 4
1.2.8 嗜水气单胞菌斑马鱼致病性实验 4
2 结果与分析 4
2.1细菌的分离鉴定 4
2.2 细菌溶血性的观察 4
2.3 分离菌株的分子鉴定 5
2.4 嗜水气单胞菌生长曲线的测定 5
2.5 嗜水气单胞菌生物被膜形成能力的测定 6
2.6 嗜水气单胞菌游动能力的测定 6
2.7嗜水气单胞菌群集运动能力的测定 7
2.8 嗜水气单胞菌斑马鱼致病性实验 8
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
南京某渔场嗜水气单胞菌的分离鉴定及特性分析
引言
气单胞菌属（Aeromonas）在 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
细菌分类学上属于气单胞菌科（Aeromonadaceae）,革兰阴性杆菌，广泛分布于各种水体环境中，在应激条件下能引起鱼类爆发出血性败血症[1, 2]，是水生动物尤其是鱼类最常见的致病菌，严重威胁渔业养殖。此外，气单胞菌是一种重要的人兽鱼共患的病原菌，还能够感染包括冷血动物在内的多种动物如禽类及哺乳类，引起败血症或皮肤溃疡等局部感染；并且能够严重威胁人体健康，引起各种肠道外和全身性感染以及胃肠道感染[3, 4]。
嗜水气单胞菌（ Aeromonas hydrophila）是一种运动性气单胞菌，是导致运动性气单胞菌败血症（MAS）的主要病原菌。1990年前后，我国淡水养殖鱼类曾经大面积暴发“细菌性败血症”，主要病原就是嗜水气单胞菌。近些年由嗜水气单胞菌引起的食物中毒、水源性肠道传染病、感染性腹泻也时有发生[5]；并且由于目前药物的不合理使用，使得对于嗜水气单胞菌病的防控难度越来越大[6, 7]。
为了解南京地区渔业生产中气单胞菌的感染情况，本试验从南京某渔场的病鱼蟹及水样中进行了气单胞菌的分离纯化培养，通过gyrB基因扩增测序方法进行菌种鉴定，并对嗜水气单胞菌进行了致病性检测，为有效预防和控制嗜水气单胞菌相关疾病的发生和传播提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集与参考菌株
本实验先后采集样品4次共分离得到12株细菌，其中1株菌分离自池塘水，7株菌分离自病鱼，4株菌分离自病蟹。参考菌株NJ35，为2010年于南京禄口分离到的一株强毒株，经16sRNA和gyrB基因测序鉴定为嗜水气单胞菌，大学兽医微生物学实验室保存有此菌株。
1.1.2 仪器和试剂
LB培养基：1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物。
血琼脂平板培养基：1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物，1.5％琼脂粉，
5％脱纤维绵羊血。
试剂：2×PCR PreMix南京诺唯赞生物科技有限公司，绵羊脱纤维红细胞购自南京鼎国生物科技有限公司，无菌PBS缓冲液（NaCl 137 mM/L，KCl 2.7 mM /L，Na2HPO4 10 mM /L，KH2PO4 2 mM /L）。
相关仪器：大型台式冷冻离心机（Heraeus），微型离心机（Eppendorf）， PCR仪（Eppendorf）、凝胶成像系统（BioRad）、紫外分光光度计（BioRad）、多功能酶标仪（MultiskanGO，Thermo Scientific）、核酸凝胶电泳仪（南京科宝仪器研究所）。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离培养与纯化
水样：用接种环蘸取水样在普通LB固体培养基上四区划线接种，28℃温箱培养24h。
病鱼：将病鱼洗净后，并用酒精棉进行消毒，在超净台里用灭菌过的手术器械将鱼剖开，取鳃、肾与肝剪开一横截面后涂抹在LB固体培养基上，后用接种环四区划线，28℃温箱培养24h。
病蟹：将病蟹洗净后，在超净台里从背部轻轻把壳敲碎，将碎片用镊子移取，避免损伤内脏，后用灭菌后的镊子取蟹心与肝胰腺（蟹黄）涂抹于LB固体培养基中，再用接种环四区划线接种，28℃温箱培养24h。
培养后，从各个平板上挑取表面光滑湿润、微凸、边缘整齐、白色或淡黄色单菌落转移至LB液体培养基中，28℃培养过夜。经过再一次划线纯化，挑取单菌落，并进行革兰染色，将镜检为革兰阴性短杆菌的菌液保存备用。
1.2.2 细菌溶血性的观察
将分离细菌纯培养物转接至LB液体培养基中，28℃、180 rpm培养46h，取10 μL菌液滴于血平板上，28℃温箱培养24 h，观察溶血环。
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