克氏螯虾血细胞形态观察与分析
血细胞是虾类免疫系统的重要组成部分，在体液免疫和细胞免疫中均起着至关重要的作用。但由于虾的种类多，且研究方法不一，对于虾类血细胞的分类，至今还没有统一的标准。本论文先利用普通光镜观察克氏螯虾血细胞新鲜状态下的变形情况，接着将螯虾的血细胞制成血涂片，瑞氏染色后在光镜下观察不同血细胞的形态并进行分类，最后用罗丹明染色后，在激光共聚焦显微镜（LSCM）下观察，可以与光镜观察结果相互印证。通过这三种方法观察螯虾血细胞，以期为虾血细胞免疫功能的研究提供一些参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2试剂 2
1.3主要仪器与软件2
1.4方法2
1.4.1活细胞变化观察2
1.4.2光镜染色观察2
1.4.3激光共聚焦显微镜观察2
2结果3
2.1活细胞变化观察结果3
2.2光镜染色观察结果4
2.3激光共聚焦显微镜观察结果5
3讨论 7
3.1活细胞变化观察与光镜染色观察结果对比 7
3.2光镜染色观察与激光共聚焦显微镜观察结果对比8
3.3光镜染色观察结果分析8
致谢9
参考文献9
克氏螯虾血细胞形态观察与分析
引言
克氏螯虾又称淡水龙虾，属甲壳动物纲、十足目、螯虾科，具有杂食性、繁殖力强、适应范围广、对环境条件要求低、生长快、抗病力强、成活率高等特点。自引人我国以来，迅速成为国内大部分地区的常见淡水虾种，在自然界广泛分布于河、沟、池塘、农田等水域中。近年来，随着市场需求量的增大，我国虾类养殖规模逐步扩大，不仅是对虾和沼虾，螯虾的养殖也趋于集约化。但随之而来的虾病却给虾类的养殖业带来严重损失，因此有关虾类的免疫学研究越来越引起国内外研究人员的广泛重视。
血细胞是虾类免疫系统的重要组成部分，在体液免疫和细胞免疫中均起着至关重要的作用。虾缺乏抗原抗体的特异性免疫反应，其免疫防御主要依赖于细 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
胞免疫和体液免疫来完成。血细胞释放免疫因子，完成凝集、黑化、吞噬、包囊及结节形成等免疫反应，在虾免疫防御中占有重要地位，但由于虾类的种类多，且研究方法不一，对于虾类血细胞的分类，至今还没有统一的标准。
本文通过普通光镜观察虾类新鲜状态下血细胞的变形情况，以及光镜瑞氏染色观察血涂片效果，以观察血细胞的形态特征(胞质中颗粒的大小)和染色特点(胞质颗粒、细胞核和细胞质的着色情况)，计算血细胞在血液中所占的比例等作为判断标准来对螯虾的血细胞进行分类。光镜染色观察操作简便、快捷，能直观地反应血细胞的形态，但是由于目前研究者采用不同的染液和染色方法对血细胞进行染色，对染色结果的解读与分析各不相同，因此光镜染色结果还存在争议。所以用激光扫描共聚焦显微镜[2]观察虾类的血细胞，可以与光镜观察结果相互印证，验证其观察结果。激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。由于其操作方便、样品制备简单、结果清晰度高、立体感强、尤其可以对活体进行直接观察、测量光学切片，在生物学各领域得到了越来越广泛的应用。通过这三种观察血细胞的方法，以期为虾类血细胞及各亚群功能的研究提供更快捷、有效的方法和一些参考资料，并为其在虾血细胞免疫功能研究中的应用打下一定的基础。
1 材料与方法
1．1 材料
实验用螯虾来自于学校池塘（图书馆旁边），选取附肢完全、健康无病、活力强的克氏原螯虾，体长在68cm之间，共17尾、（载玻片、盖玻片、染色架、1mL一次性注射器、1mm标尺）
1．2 试剂
瑞氏染液、荧光染料罗丹明、10%的甲醛固定液、50%的乙醇、香柏油、二甲苯
1．3 主要仪器
奥林巴斯光学显微镜OLYMPUS CX21、 德国 Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜LSM710、 MiE3.0图像处理系统、ZEN2011图像处理软件、Image J软件(免费下载的JAVA图像分析与处理软件)
1．4 方法
1．4．1 活细胞变化观察
用1mL一次性注射器从螯虾背侧的头胸甲与腹甲之间的软皮中，插入围心腔，直接吸取0.1mL的螯虾血液至载玻片，然后迅速加盖盖玻片，在40×光镜或油镜下观察并拍照螯虾血细胞在新鲜状态下的变化，实验共用螯虾10尾 。
1．4．2 光镜染色观察
首先用1mL一次性注射器吸取0.1mL，10%甲醛固定液，再插入螯虾的围心腔吸取等量的螯虾血液，使螯虾血细胞可在注射器内固定，并迅速制成血涂片[2]。实验共用螯虾5尾，每只虾血涂片制2张。
然后待血涂片自然干燥后，用瑞氏染液对血涂片进行染色，染色时间约5min，水洗，50%的乙醇分色5s，水洗。
最后，待染色后的血涂片干燥后，随机选取螯虾血涂片的视野，在40×光镜或油镜下观察血细胞的染色情况。每张血涂片在油镜下随机选取100个细胞，观察血细胞的形态特征(胞质中颗粒的大小)和染色特点(胞质颗粒、细胞核和细胞质的着色情况)，同时对血细胞进行分类统计。在这100个细胞中，随机选取20个血细胞，在油镜下观察并用MiE3.0图像处理系统拍照，同时观察拍照1mm标尺，然后用Image J软件测量血细胞及核的长径和短径，计算核质比（细胞核长径与细胞长径的比值）。
1．4．3 激光共聚焦显微镜观察
首先用1mL一次性注射器吸取0.1mL，10%甲醛固定液，再插入虾的围心腔吸取等量的螯虾血液，使螯虾血细胞可在注射器内固定。
然后迅速制成血涂片，待血涂片干燥后，用红棕色的荧光染液罗丹明对涂片滴加染色，染色时间约5min，擦干。或者直接用注射器直接抽取一滴（约0.1mL）罗丹明，滴加到玻片，加盖盖玻片，观察悬浮的血细胞。实验共用螯虾2尾。
打开LSM710系统，电脑开机进入操作系统界面后，点击进入桌面共聚焦软件ZEN，单击Locate，并设置BF、DAPI、Rhod、FITC四个通道与参数，使在不同通道下观察血细胞的荧光染色情况。在目镜下找到目标血细胞后，（注意：在40×以上观察时，由于玻片太厚，故血细胞面朝向物镜），进行扫描取图，计算机数据采集，数字成像。最后随机选取20个血细胞，利用软件ZEN的图片处理功能，测量血细胞及核的长径和短径，并计算核质比。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2试剂 2
1.3主要仪器与软件2
1.4方法2
1.4.1活细胞变化观察2
1.4.2光镜染色观察2
1.4.3激光共聚焦显微镜观察2
2结果3
2.1活细胞变化观察结果3
2.2光镜染色观察结果4
2.3激光共聚焦显微镜观察结果5
3讨论 7
3.1活细胞变化观察与光镜染色观察结果对比 7
3.2光镜染色观察与激光共聚焦显微镜观察结果对比8
3.3光镜染色观察结果分析8
致谢9
参考文献9
克氏螯虾血细胞形态观察与分析
引言
克氏螯虾又称淡水龙虾，属甲壳动物纲、十足目、螯虾科，具有杂食性、繁殖力强、适应范围广、对环境条件要求低、生长快、抗病力强、成活率高等特点。自引人我国以来，迅速成为国内大部分地区的常见淡水虾种，在自然界广泛分布于河、沟、池塘、农田等水域中。近年来，随着市场需求量的增大，我国虾类养殖规模逐步扩大，不仅是对虾和沼虾，螯虾的养殖也趋于集约化。但随之而来的虾病却给虾类的养殖业带来严重损失，因此有关虾类的免疫学研究越来越引起国内外研究人员的广泛重视。
血细胞是虾类免疫系统的重要组成部分，在体液免疫和细胞免疫中均起着至关重要的作用。虾缺乏抗原抗体的特异性免疫反应，其免疫防御主要依赖于细 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
胞免疫和体液免疫来完成。血细胞释放免疫因子，完成凝集、黑化、吞噬、包囊及结节形成等免疫反应，在虾免疫防御中占有重要地位，但由于虾类的种类多，且研究方法不一，对于虾类血细胞的分类，至今还没有统一的标准。
本文通过普通光镜观察虾类新鲜状态下血细胞的变形情况，以及光镜瑞氏染色观察血涂片效果，以观察血细胞的形态特征(胞质中颗粒的大小)和染色特点(胞质颗粒、细胞核和细胞质的着色情况)，计算血细胞在血液中所占的比例等作为判断标准来对螯虾的血细胞进行分类。光镜染色观察操作简便、快捷，能直观地反应血细胞的形态，但是由于目前研究者采用不同的染液和染色方法对血细胞进行染色，对染色结果的解读与分析各不相同，因此光镜染色结果还存在争议。所以用激光扫描共聚焦显微镜[2]观察虾类的血细胞，可以与光镜观察结果相互印证，验证其观察结果。激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。由于其操作方便、样品制备简单、结果清晰度高、立体感强、尤其可以对活体进行直接观察、测量光学切片，在生物学各领域得到了越来越广泛的应用。通过这三种观察血细胞的方法，以期为虾类血细胞及各亚群功能的研究提供更快捷、有效的方法和一些参考资料，并为其在虾血细胞免疫功能研究中的应用打下一定的基础。
1 材料与方法
1．1 材料
实验用螯虾来自于学校池塘（图书馆旁边），选取附肢完全、健康无病、活力强的克氏原螯虾，体长在68cm之间，共17尾、（载玻片、盖玻片、染色架、1mL一次性注射器、1mm标尺）
1．2 试剂
瑞氏染液、荧光染料罗丹明、10%的甲醛固定液、50%的乙醇、香柏油、二甲苯
1．3 主要仪器
奥林巴斯光学显微镜OLYMPUS CX21、 德国 Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜LSM710、 MiE3.0图像处理系统、ZEN2011图像处理软件、Image J软件(免费下载的JAVA图像分析与处理软件)
1．4 方法
1．4．1 活细胞变化观察
用1mL一次性注射器从螯虾背侧的头胸甲与腹甲之间的软皮中，插入围心腔，直接吸取0.1mL的螯虾血液至载玻片，然后迅速加盖盖玻片，在40×光镜或油镜下观察并拍照螯虾血细胞在新鲜状态下的变化，实验共用螯虾10尾 。
1．4．2 光镜染色观察
首先用1mL一次性注射器吸取0.1mL，10%甲醛固定液，再插入螯虾的围心腔吸取等量的螯虾血液，使螯虾血细胞可在注射器内固定，并迅速制成血涂片[2]。实验共用螯虾5尾，每只虾血涂片制2张。
然后待血涂片自然干燥后，用瑞氏染液对血涂片进行染色，染色时间约5min，水洗，50%的乙醇分色5s，水洗。
最后，待染色后的血涂片干燥后，随机选取螯虾血涂片的视野，在40×光镜或油镜下观察血细胞的染色情况。每张血涂片在油镜下随机选取100个细胞，观察血细胞的形态特征(胞质中颗粒的大小)和染色特点(胞质颗粒、细胞核和细胞质的着色情况)，同时对血细胞进行分类统计。在这100个细胞中，随机选取20个血细胞，在油镜下观察并用MiE3.0图像处理系统拍照，同时观察拍照1mm标尺，然后用Image J软件测量血细胞及核的长径和短径，计算核质比（细胞核长径与细胞长径的比值）。
1．4．3 激光共聚焦显微镜观察
首先用1mL一次性注射器吸取0.1mL，10%甲醛固定液，再插入虾的围心腔吸取等量的螯虾血液，使螯虾血细胞可在注射器内固定。
然后迅速制成血涂片，待血涂片干燥后，用红棕色的荧光染液罗丹明对涂片滴加染色，染色时间约5min，擦干。或者直接用注射器直接抽取一滴（约0.1mL）罗丹明，滴加到玻片，加盖盖玻片，观察悬浮的血细胞。实验共用螯虾2尾。
打开LSM710系统，电脑开机进入操作系统界面后，点击进入桌面共聚焦软件ZEN，单击Locate，并设置BF、DAPI、Rhod、FITC四个通道与参数，使在不同通道下观察血细胞的荧光染色情况。在目镜下找到目标血细胞后，（注意：在40×以上观察时，由于玻片太厚，故血细胞面朝向物镜），进行扫描取图，计算机数据采集，数字成像。最后随机选取20个血细胞，利用软件ZEN的图片处理功能，测量血细胞及核的长径和短径，并计算核质比。
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