鱼源无乳链球菌苯甲酰甘氨酸氨基水解酶的原核表达及抗体制备
近年来，无乳链球菌已经成为世界性、多地区、多个品种鱼类的主要病原菌，尤其是对温水性鱼类危害严重。本试验提取无乳链球菌GD201008-001株的基因组DNA为模板，PCR扩增出苯甲酰甘氨酸氨基水解酶（Hip）基因，构建了重组质粒pET32a(+)-hipO, 将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)后,经 IPTG诱导表达重组蛋白。表达的重组蛋白经纯化、复性后免疫家兔获得多克隆抗体, 再对多克隆抗体进行ELISA和Western blot分析。结果显示，该重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，大小约为61kD；多克隆抗体效价为1:12800，能够与重组蛋白特异性结合，抗体制备成功。该试验为深入研究苯甲酰甘氨酸氨基水解酶的生物学和免疫学功能分析及无乳链球菌的致病机制奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 hipO基因的克隆及重组表达质粒的构建2
1.2.2 重组蛋白的诱导表达3
1.2.3 重组蛋白的纯化4
1.2.4 重组蛋白的抗体制备4
1.2.5 ELISA检查多克隆抗体效价4
1.2.6 Western blot 分析4
2 结果与分析5
2.1 hipO基因的克隆和重组表达质粒5
2.2 重组蛋白的表达及纯化5
2.3 多克隆抗体的免疫学分析6
3 讨论 6
致谢7
参考文献7
鱼源无乳链球菌苯甲酰甘氨酸氨基水解酶的原核 表达及抗体制备
引言
无乳链球菌（Streptococcus agalactiae），又称为B族链球菌（Group B Streptococcus, GBS），为革兰氏阳性菌，宿主范围广泛，能够引起新生儿败血症、脑膜炎、肺炎、奶牛乳腺炎及鱼类脑膜炎等疾病，是一种人、畜、鱼共患的病原菌 [13]。已有研究表明，无乳链球菌可单独致病机体，也可与其他致病菌协同感染[4]。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
自从 Meyer和Robinsonand 于1966年首次报道了鱼类的链球菌病，并从淡水金色美鳊（Notemigonus crysoleucas）体内分离出B族非溶血链球菌以来[5]，多次出现了鱼类因无乳链球菌感染而大量死亡的报道[610]，并且这种感染现象在20世纪90年代后呈现上升趋势。目前，无乳链球菌已成为重要的鱼类致病菌。
罗非鱼（Tilapia）是我国淡水养殖鱼类的主要品种，具有抗病力强的特点，但最近几年发现罗非鱼链球菌病在小范围流行，并导致20%30%的死亡率[1113]。2006年，张新艳等[14]在广州患病罗非鱼体内分离到无乳链球菌，这是国内关于罗非鱼感染无乳链球菌的首例报道。2009年，福建、广西、广东和海南等罗非鱼的主要养殖区爆发了严重的链球菌病，其发病率为20%50%，死亡率为50%70%，甚至更高[15]。研究发现，鱼源无乳链球菌致病性和传染性极强，对鱼类的致死率可达100%，但其致病机制仍不清楚[16]。
本试验研究的hipO基因是无乳链球菌GD201008001株在巨噬细胞内存活过程中表达上调的基因。通过MEROPS数据库比对氨基酸序列发现，苯甲酰甘氨酸氨基水解酶（benzoylglycine amidohydrolase），亦称为马尿酸酶（hippuricase, Hip），属于锌金属肽酶超家族中的M20D家族。苯甲酰甘氨酸氨基水解酶能够将N苯甲酰甘氨酸分解为苯甲酸和甘氨酸[17]。目前，苯甲酰甘氨酸氨基水解酶在无乳链球菌致病过程中所发挥的作用尚未明确，亟待研究。
本试验扩增了鱼源无乳链球菌hipO基因的功能区序列（1209bp），在大肠杆菌中进行原核表达，并在纯化后将该重组蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体，为后续研究苯甲酰甘氨酸氨基水解酶的特性及其在无乳链球菌致病过程中的作用奠定了基础。
材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌株、质粒及实验动物
鱼源无乳链球菌GD201008001是由本实验室自广东养殖区感染发病的罗非鱼体内分离得到。大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自南京诺唯赞公司，质粒pET32a(+)为本实验室保存。大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）培养条件为：LB培养基，37℃摇床180rpm；链球菌培养条件为：THB培养基，37℃摇床180rpm。家兔购自江苏省农科院种兔场。
1.1.2 仪器和试剂
PrimeSTAR Max DNA聚合酶、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、DNA Gel Purification Kit、蛋白Marker购自TaKaRa公司（大连）；细菌DNA提取试剂盒、细菌质粒提取试剂盒购自OMEGA公司； Montanide ISA 206 VG佐剂购自SEPPIC公司；2×PCR PreMix购自南京诺唯赞公司；Histag 凝胶亲和柱为Novagen公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG二抗、DAB显色试剂盒、TMB显色试剂盒、氨苄青霉素及IPTG均购自北京鼎国生物技术有限公司，其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。
大型台式冷冻离心机为Heraeus公司产品，微型离心机为Eppendorf公司产品，SDSPAGE电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计和多功能酶标仪均为BioRad公司产品。
1.2 方法
1.2.1 hipO基因的克隆及重组表达质粒的构建
hipO基因完整的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为1215bp，应用Primer5.0软件设计一对引物，并在上、下游引物的5′端分别引入酶切位点BamH I和Hind III，上游引物序列：5′ CGC GGATCC GCCAATGCATCTTTGCGACAT 3′（划线部分为酶切位点BamH I），下游引物序列：5′ CCC AAGCTT TTATTCTCCTTCTACAAGCATAGC 3′（划线部分为酶切位点Hind III）。该对引物预期可扩增出1209 bp的片段。
按说明书使用DNA提取试剂盒提取GD201008001基因组为模板，PCR扩增hipO基因序列。以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，先以 15μL反应体系摸索最适反应程序，而后以50μL反应体系大量扩增hipO基因。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 hipO基因的克隆及重组表达质粒的构建2
1.2.2 重组蛋白的诱导表达3
1.2.3 重组蛋白的纯化4
1.2.4 重组蛋白的抗体制备4
1.2.5 ELISA检查多克隆抗体效价4
1.2.6 Western blot 分析4
2 结果与分析5
2.1 hipO基因的克隆和重组表达质粒5
2.2 重组蛋白的表达及纯化5
2.3 多克隆抗体的免疫学分析6
3 讨论 6
致谢7
参考文献7
鱼源无乳链球菌苯甲酰甘氨酸氨基水解酶的原核 表达及抗体制备
引言
无乳链球菌（Streptococcus agalactiae），又称为B族链球菌（Group B Streptococcus, GBS），为革兰氏阳性菌，宿主范围广泛，能够引起新生儿败血症、脑膜炎、肺炎、奶牛乳腺炎及鱼类脑膜炎等疾病，是一种人、畜、鱼共患的病原菌 [13]。已有研究表明，无乳链球菌可单独致病机体，也可与其他致病菌协同感染[4]。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
自从 Meyer和Robinsonand 于1966年首次报道了鱼类的链球菌病，并从淡水金色美鳊（Notemigonus crysoleucas）体内分离出B族非溶血链球菌以来[5]，多次出现了鱼类因无乳链球菌感染而大量死亡的报道[610]，并且这种感染现象在20世纪90年代后呈现上升趋势。目前，无乳链球菌已成为重要的鱼类致病菌。
罗非鱼（Tilapia）是我国淡水养殖鱼类的主要品种，具有抗病力强的特点，但最近几年发现罗非鱼链球菌病在小范围流行，并导致20%30%的死亡率[1113]。2006年，张新艳等[14]在广州患病罗非鱼体内分离到无乳链球菌，这是国内关于罗非鱼感染无乳链球菌的首例报道。2009年，福建、广西、广东和海南等罗非鱼的主要养殖区爆发了严重的链球菌病，其发病率为20%50%，死亡率为50%70%，甚至更高[15]。研究发现，鱼源无乳链球菌致病性和传染性极强，对鱼类的致死率可达100%，但其致病机制仍不清楚[16]。
本试验研究的hipO基因是无乳链球菌GD201008001株在巨噬细胞内存活过程中表达上调的基因。通过MEROPS数据库比对氨基酸序列发现，苯甲酰甘氨酸氨基水解酶（benzoylglycine amidohydrolase），亦称为马尿酸酶（hippuricase, Hip），属于锌金属肽酶超家族中的M20D家族。苯甲酰甘氨酸氨基水解酶能够将N苯甲酰甘氨酸分解为苯甲酸和甘氨酸[17]。目前，苯甲酰甘氨酸氨基水解酶在无乳链球菌致病过程中所发挥的作用尚未明确，亟待研究。
本试验扩增了鱼源无乳链球菌hipO基因的功能区序列（1209bp），在大肠杆菌中进行原核表达，并在纯化后将该重组蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体，为后续研究苯甲酰甘氨酸氨基水解酶的特性及其在无乳链球菌致病过程中的作用奠定了基础。
材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌株、质粒及实验动物
鱼源无乳链球菌GD201008001是由本实验室自广东养殖区感染发病的罗非鱼体内分离得到。大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自南京诺唯赞公司，质粒pET32a(+)为本实验室保存。大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）培养条件为：LB培养基，37℃摇床180rpm；链球菌培养条件为：THB培养基，37℃摇床180rpm。家兔购自江苏省农科院种兔场。
1.1.2 仪器和试剂
PrimeSTAR Max DNA聚合酶、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、DNA Gel Purification Kit、蛋白Marker购自TaKaRa公司（大连）；细菌DNA提取试剂盒、细菌质粒提取试剂盒购自OMEGA公司； Montanide ISA 206 VG佐剂购自SEPPIC公司；2×PCR PreMix购自南京诺唯赞公司；Histag 凝胶亲和柱为Novagen公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG二抗、DAB显色试剂盒、TMB显色试剂盒、氨苄青霉素及IPTG均购自北京鼎国生物技术有限公司，其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。
大型台式冷冻离心机为Heraeus公司产品，微型离心机为Eppendorf公司产品，SDSPAGE电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计和多功能酶标仪均为BioRad公司产品。
1.2 方法
1.2.1 hipO基因的克隆及重组表达质粒的构建
hipO基因完整的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为1215bp，应用Primer5.0软件设计一对引物，并在上、下游引物的5′端分别引入酶切位点BamH I和Hind III，上游引物序列：5′ CGC GGATCC GCCAATGCATCTTTGCGACAT 3′（划线部分为酶切位点BamH I），下游引物序列：5′ CCC AAGCTT TTATTCTCCTTCTACAAGCATAGC 3′（划线部分为酶切位点Hind III）。该对引物预期可扩增出1209 bp的片段。
按说明书使用DNA提取试剂盒提取GD201008001基因组为模板，PCR扩增hipO基因序列。以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，先以 15μL反应体系摸索最适反应程序，而后以50μL反应体系大量扩增hipO基因。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/609.html
