剖腹取胎与胚胎移植技术在实验动物生物净化应用的比较
在普通环境下饲养动物，常携带多种病原微生物。这些病原体的存在无疑会对相关实验的结果产生干扰，所以必须对其进行生物净化。当今国际上公认的比较理想的净化种群的方法就是剖腹取胎和胚胎移植技术。本文分别利用这两种方式对实验小鼠进行生物净化，通过比较两种方式下所得后代小鼠存活个数和存活率，找出两种方式的优势和劣势。实验数据表明，剖腹取胎和胚胎移植下的后代小鼠存活数不一，但剖腹取胎时间较短，技术难度较低。而胚胎移植下的幼仔成活率均为100%，高于剖腹取胎。这些结果为快速、安全且保质的动物保种计划提供理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1.1.1实验动物 2
1.1.2实验材料 2
1．2 实验方法 3
1.2.1剖腹取胎实验 3
1.2.2胚胎移植实验 3
2 实验结果与分析 5
2.1剖腹取胎实验结果 5
2.2胚胎移植实验结果 5
2.3实验结果分析 6
2.3.1比较两种方式所得后代存活个数 6
2.3.2比较两种方式后代小仔存活率 6
3 讨论 6
致谢 7
参考文献： 8
剖腹取胎与胚胎移植技术在实验动物生物净化应用的比较
引言
实验动物是指经人工培育，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或来源清楚，用于科学研究、教学、生物制品或药品鉴定以及其他科学实验的动物。
随着生物科学的不断发展，对实验动物的要求越来越高。提高实验动物的质量，不仅要有良好的设施、环境和饲育方法，而且要不断地提高动物本身的质量。由于实验动物的致病性疾病多为隐性感染，对小鼠的生长、发育、繁殖和试验都有一定的影响，有些疾病是人畜共患性传染病，对人类也有很大危害。为此，需要标准化SPF级小鼠品系种以满足各项实验的供应。剖腹取胎和胚胎移植技术是当今国际上公认的比较理想的净化种群的方法。
国内外均在剖腹取胎和胚胎移植技术上取 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
得了一定的进展。1959年，Wostomann和Pleasans首次报道经剖腹取胎子宫摘除术，人工哺乳培育成功无菌兔[1]。现代科学研究表明，胎盘具有屏障的作用，可阻止病原微生物侵入。采取无菌剖腹取胎手术，切断了母仔纵向传播疾病的途径，是小鼠进行“生物净化”维持种群微生物级别最简单而有效的手段。田小芸等用SPF级ICR小鼠代乳净化C57BL/KsJ小鼠获得成功[2]。隋世燕等表明，将胚胎冷冻技术与净化技术结合起来，建立胚胎库，使用时再将其解冻，移植给无菌级或SPF级动物，则可使实验动物的净化达到新的水平[3]。由此可见，标准化的SPF级实验动物是我国医药制品、生物技术领域发展的基础，是与国际接轨的前提保证[4,5]。
本实验将剖腹取胎与胚胎移植技术分别应用于实验小鼠，并对两种技术之间的优缺点进行了探索比较，为能制定时间最短、最安全且保质的实验动物的保种计划提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
本实验所用材料，包括实验动物和实验器材，均由实习单位南京大学—南京生物医药研究院提供。
1.1.1实验动物
C57BL/6J：简称B6J，如图1所示，是国际通用的近交系小鼠[6]。 怀孕母鼠5只、4周龄雌鼠5只、6周龄雌鼠5只。
NDR1；NDR2：全称B6;129P2NDR1tmNDR2tm3.3tamcre，如图2所示，基因敲除品系小鼠。怀孕母鼠1只、4周龄雌鼠1只、6周龄雌鼠1只。
PrnpAbcal：全称B6.CgTg(PrnpAbcal)Ehol/JNju，如图3所示，转基因小鼠品系。怀孕母鼠2只、4周龄雌鼠2只、6周龄雌鼠2只。
1.1.2实验材料
器械：一次性注射器（1ml）、手术剪（18cm）、手术剪（12.5cm、直圆）、手术剪（12.5cm、直尖）、显微镊（无钩）、止血钳、250ml烧杯、灭菌滤纸、玻璃平皿；超净台、一次性手套、热台、净化服。
试剂：孕马血清促性腺激素（PMSG），购自宁波三生药业有限公司；人绒毛膜促性腺激素（HCG），购自宁波三生药业有限公司；戊巴比妥钠，购于中国医药（集团）上海化学试剂公司；DPBS：DPBS干粉购自GIBCO公司；操作液M2：购自Sigma公司。其他试剂，包括2%过氧乙酸、75%乙醇、0.9%灭菌生理盐水，等。
1．2 实验方法
1.2.1剖腹取胎实验
1.2.1.1手术
隔离检疫室一内
①将母鼠用颈椎脱臼法处死后，在2%的过氧乙酸中浸泡23s，用75%乙醇将毛打湿进行消毒。然后将母鼠置于灭菌滤纸上，剪开皮肤和肌肉，暴露腹腔；
②用无菌止血钳夹住近肛门处子宫颈，再用无菌剪刀从止血钳的肛门一侧剪断子宫，取下整个子宫；
③将子宫投入2%过氧乙酸烧杯内浸泡23s，再用0.9%生理盐水迅速冲洗一下，放入灭菌的玻璃平皿内，迅速转移入隔离检疫室一与隔离检疫室二之间的喷过氧乙酸的传递窗。
注意：在隔离检疫室一时需将玻璃平皿的盖子打开，在隔离检疫室二拿取时应避免接触玻璃平皿。
隔离检疫室二内
④用镊子从玻璃平皿内拎出子宫，拿到超净台内，将子宫置于滤纸上，迅速剖开子宫，并将剖出小鼠的身体及口鼻中粘液迅速擦干，然后将小鼠放于热台上（提前调温度至40℃），不时用镊子刺激小鼠尾部及四肢，使小鼠发声，尽快转为肺呼吸，小鼠颜色慢慢地由紫色变为粉红色。
1.2.1.2代乳
剖腹取胎后的小仔，应选择有代乳能力的SPF等级的母鼠进行代乳，以保证满足小仔的生存。
代乳鼠为南京大学模式动物研究所的Nu杂合子品系。选取条件为：已产过1胎，仔鼠成活率高，母性强，有哺乳经验的雌鼠。代乳母鼠应在待剖腹母鼠手术前1～2d内分娩为宜。
代乳时，将代养母鼠从笼中取出，将代乳母鼠的仔鼠全部弃掉或保留2～4只，用代乳母鼠盒中垫料撒在剖腹产仔鼠身上，或者挤压代乳母鼠尿液，涂抹于小仔身上，使其染味后放入代乳母鼠盒中，并观察代乳情况[7]。若代乳情况不好，需及时更换代乳鼠。
1.2.2胚胎移植实验
胚胎移植是转基因动物产生和胚胎工程中的关键技术之一[8], 是一项难度较高的显微操作过程。
1.2.2.1胚胎移植前期准备
1）超排
雌鼠的日龄和性成熟程度是影响超排的主要原因之一[9]。国外实验室，除特殊情况外，一般选用3～6 周龄雌鼠为超排卵母细胞的供鼠[10]。南京大学—南京生物医药研究院多次实验证明选取4周左右小鼠超排结果最理想。在注射PMSG 之后，间隔48 h 是注射外源HCG 触发小鼠同步排卵的最佳时间[10,11]。大多数品系的小鼠在注射HCG 10~13 h 排卵。这时是采集卵母细胞的最佳时间[911]。
①在17：00时，对4周龄的雌鼠进行腹腔注射PMSG，每只注射0.1ml（5IU）。
②在48h后，即第三天的17:00时，再继续给雌鼠腹腔注射0.1ml的HCG（5IU）。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1.1.1实验动物 2
1.1.2实验材料 2
1．2 实验方法 3
1.2.1剖腹取胎实验 3
1.2.2胚胎移植实验 3
2 实验结果与分析 5
2.1剖腹取胎实验结果 5
2.2胚胎移植实验结果 5
2.3实验结果分析 6
2.3.1比较两种方式所得后代存活个数 6
2.3.2比较两种方式后代小仔存活率 6
3 讨论 6
致谢 7
参考文献： 8
剖腹取胎与胚胎移植技术在实验动物生物净化应用的比较
引言
实验动物是指经人工培育，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或来源清楚，用于科学研究、教学、生物制品或药品鉴定以及其他科学实验的动物。
随着生物科学的不断发展，对实验动物的要求越来越高。提高实验动物的质量，不仅要有良好的设施、环境和饲育方法，而且要不断地提高动物本身的质量。由于实验动物的致病性疾病多为隐性感染，对小鼠的生长、发育、繁殖和试验都有一定的影响，有些疾病是人畜共患性传染病，对人类也有很大危害。为此，需要标准化SPF级小鼠品系种以满足各项实验的供应。剖腹取胎和胚胎移植技术是当今国际上公认的比较理想的净化种群的方法。
国内外均在剖腹取胎和胚胎移植技术上取 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
得了一定的进展。1959年，Wostomann和Pleasans首次报道经剖腹取胎子宫摘除术，人工哺乳培育成功无菌兔[1]。现代科学研究表明，胎盘具有屏障的作用，可阻止病原微生物侵入。采取无菌剖腹取胎手术，切断了母仔纵向传播疾病的途径，是小鼠进行“生物净化”维持种群微生物级别最简单而有效的手段。田小芸等用SPF级ICR小鼠代乳净化C57BL/KsJ小鼠获得成功[2]。隋世燕等表明，将胚胎冷冻技术与净化技术结合起来，建立胚胎库，使用时再将其解冻，移植给无菌级或SPF级动物，则可使实验动物的净化达到新的水平[3]。由此可见，标准化的SPF级实验动物是我国医药制品、生物技术领域发展的基础，是与国际接轨的前提保证[4,5]。
本实验将剖腹取胎与胚胎移植技术分别应用于实验小鼠，并对两种技术之间的优缺点进行了探索比较，为能制定时间最短、最安全且保质的实验动物的保种计划提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
本实验所用材料，包括实验动物和实验器材，均由实习单位南京大学—南京生物医药研究院提供。
1.1.1实验动物
C57BL/6J：简称B6J，如图1所示，是国际通用的近交系小鼠[6]。 怀孕母鼠5只、4周龄雌鼠5只、6周龄雌鼠5只。
NDR1；NDR2：全称B6;129P2NDR1tmNDR2tm3.3tamcre，如图2所示，基因敲除品系小鼠。怀孕母鼠1只、4周龄雌鼠1只、6周龄雌鼠1只。
PrnpAbcal：全称B6.CgTg(PrnpAbcal)Ehol/JNju，如图3所示，转基因小鼠品系。怀孕母鼠2只、4周龄雌鼠2只、6周龄雌鼠2只。
1.1.2实验材料
器械：一次性注射器（1ml）、手术剪（18cm）、手术剪（12.5cm、直圆）、手术剪（12.5cm、直尖）、显微镊（无钩）、止血钳、250ml烧杯、灭菌滤纸、玻璃平皿；超净台、一次性手套、热台、净化服。
试剂：孕马血清促性腺激素（PMSG），购自宁波三生药业有限公司；人绒毛膜促性腺激素（HCG），购自宁波三生药业有限公司；戊巴比妥钠，购于中国医药（集团）上海化学试剂公司；DPBS：DPBS干粉购自GIBCO公司；操作液M2：购自Sigma公司。其他试剂，包括2%过氧乙酸、75%乙醇、0.9%灭菌生理盐水，等。
1．2 实验方法
1.2.1剖腹取胎实验
1.2.1.1手术
隔离检疫室一内
①将母鼠用颈椎脱臼法处死后，在2%的过氧乙酸中浸泡23s，用75%乙醇将毛打湿进行消毒。然后将母鼠置于灭菌滤纸上，剪开皮肤和肌肉，暴露腹腔；
②用无菌止血钳夹住近肛门处子宫颈，再用无菌剪刀从止血钳的肛门一侧剪断子宫，取下整个子宫；
③将子宫投入2%过氧乙酸烧杯内浸泡23s，再用0.9%生理盐水迅速冲洗一下，放入灭菌的玻璃平皿内，迅速转移入隔离检疫室一与隔离检疫室二之间的喷过氧乙酸的传递窗。
注意：在隔离检疫室一时需将玻璃平皿的盖子打开，在隔离检疫室二拿取时应避免接触玻璃平皿。
隔离检疫室二内
④用镊子从玻璃平皿内拎出子宫，拿到超净台内，将子宫置于滤纸上，迅速剖开子宫，并将剖出小鼠的身体及口鼻中粘液迅速擦干，然后将小鼠放于热台上（提前调温度至40℃），不时用镊子刺激小鼠尾部及四肢，使小鼠发声，尽快转为肺呼吸，小鼠颜色慢慢地由紫色变为粉红色。
1.2.1.2代乳
剖腹取胎后的小仔，应选择有代乳能力的SPF等级的母鼠进行代乳，以保证满足小仔的生存。
代乳鼠为南京大学模式动物研究所的Nu杂合子品系。选取条件为：已产过1胎，仔鼠成活率高，母性强，有哺乳经验的雌鼠。代乳母鼠应在待剖腹母鼠手术前1～2d内分娩为宜。
代乳时，将代养母鼠从笼中取出，将代乳母鼠的仔鼠全部弃掉或保留2～4只，用代乳母鼠盒中垫料撒在剖腹产仔鼠身上，或者挤压代乳母鼠尿液，涂抹于小仔身上，使其染味后放入代乳母鼠盒中，并观察代乳情况[7]。若代乳情况不好，需及时更换代乳鼠。
1.2.2胚胎移植实验
胚胎移植是转基因动物产生和胚胎工程中的关键技术之一[8], 是一项难度较高的显微操作过程。
1.2.2.1胚胎移植前期准备
1）超排
雌鼠的日龄和性成熟程度是影响超排的主要原因之一[9]。国外实验室，除特殊情况外，一般选用3～6 周龄雌鼠为超排卵母细胞的供鼠[10]。南京大学—南京生物医药研究院多次实验证明选取4周左右小鼠超排结果最理想。在注射PMSG 之后，间隔48 h 是注射外源HCG 触发小鼠同步排卵的最佳时间[10,11]。大多数品系的小鼠在注射HCG 10~13 h 排卵。这时是采集卵母细胞的最佳时间[911]。
①在17：00时，对4周龄的雌鼠进行腹腔注射PMSG，每只注射0.1ml（5IU）。
②在48h后，即第三天的17:00时，再继续给雌鼠腹腔注射0.1ml的HCG（5IU）。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/603.html
