抗猪流行性腹泻病毒药物的筛选研究
猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一类急性、高度接触性传染病。PEDV主要在体内感染小肠上皮细胞，而引起明显的绒毛萎缩，导致急性吸收不良综合征，所有年龄段的猪均出现水样腹泻，呕吐和厌食症状。PEDV感染导致高发病率和死亡率，特别是在哺乳仔猪中，这造成了养猪业的巨大经济损失。PED 的传播范围遍及全世界，目前，虽然有商业PEDV疫苗，但是免疫效果仍不理想，临床上持续有PED的暴发，因此，迫切需要有效的抗PEDV药物。本研究通过利用高通量ELISA方法从90种药物中筛选出了3种具有抗PEDV作用的药物，并通过间接免疫荧光，荧光定量PCR，蛋白质免疫印迹方法进一步验证。证实了3种药物在细胞水平均对PEDV有抑制作用，这可以为PED的预防和治疗提供依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1细胞与毒株 2
1.1.2 主要仪器 2
1.1.3 主要试剂 3
1.1.4 主要试剂及其配制 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 配制药物浓度 3
1.2.2 细胞培养 3
1.2.3进行药物初步筛选 3
1.2.4 间接免疫荧光试验 4
1.2.5 TaqMan法荧光定量PCR检测 4
1.2.6 蛋白质印迹法 5
1.2.7 统计分析 5
2 结果与分析 5
2.1药物的细胞毒性分析 5
2.2药物初步筛选结果 5
2.3 间接免疫荧光试验结果 6
2.4 荧光定量PCR结果 7
2.5 蛋白印迹结果 9
3讨论 9
致谢 10
参考文献 11 抗猪流行性腹泻病毒药物的筛选研究
引言
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病。主要临床症状为呕吐、腹泻、食欲下降和脱水，PED具有传染速度快、传染方式多、发病速度快等特点。不同性别、日龄和品种的猪均可感染，野猪亦可感染，仔猪和育成猪的发病率通常为 100 %，母猪为 15 %～90 %，这给养猪业造成了很大经济损失[1]。本病的流行特点、临床症状和猪传染性胃肠炎十分相似，临床上很难区分。
1976年，PEDV首次在中国报道，20世纪80年代后该病在中国广泛传播，造成严重经济损失，并在亚洲蔓延[2]。在2010年末，中国报道了与经典菌株相比发病率增加的“变种”PEDV毒株，其引起PED的大规模暴发，并被认为是第一个流行毒株[3]。2013年4月，在美国首次发现高致病性PEDV，并迅速蔓延至31个州以及墨西哥和加拿大。PEDV流行毒株的基因组与我国毒株的同源性高达97%99%，造成的临床疫情与发病猪的死亡情况皆与我国类似，对美国的养猪生产同样造成了不可估量的损失[46]。近年来，PED的频繁爆发，使其成为世界范围的猪传染病，PEDV已成为国内外兽医领域关注的重要病原之一 [79]。
猪流行性腹泻病毒是尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科 (Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus) I群成员之一。I群冠状病毒家族还包括猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、人类冠状病毒229E (Human coronavirus 229E, HCoV229E)等[1011]。从发现PEDV以来，人们先后尝试用不同的方法将PEDV适应细胞，均没有取得成功。直到1988年，Hofmann 等在培养基中加入胰酶首次使 PEDV成功的在Vero 细胞上繁殖。目前主要利用Vero传代细胞分离培养PEDV，也有报道用PK和ST细胞培养本病毒[1213]。
PEDV是单股正链RNA病毒,核酸具有感染性。全基因组长度约28 kb, 基因组包含编码复制酶（Rep）、纤突糖蛋白（S）、基质蛋白（M）、囊膜蛋白（E）、核蛋白（N）和ORF3等六个基因。其中复制酶是与蛋白复制有关的多聚蛋白。S蛋白是位于PEDV粒子表面的纤突蛋白，在病毒的侵入中发挥关键作用，且本病毒核酸的高变区主要在S基因上，因此S基因不仅在疫苗的设计上具有重要参考价值，而且也是分析毒株变异的参考基因。ORF3蛋白与病毒毒力调控病毒的复制。N蛋白是病毒的核衣壳蛋白，与基因组RNA相互缠绕形成螺旋的核衣壳，并具有高度保守性。猪在感染PEDV的早期体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体，所以N蛋白的存在对于本病诊断具有重要意义。M基因在病毒的组装和出芽过程中起重要作用，同时介导机体产生中和抗体[14]。作为RNA病毒，PEDV在选择压力作用下容易发生突变，且可能导致新的变异株的频繁出现[1516]。虽然PEDV只有一个血清型，但在不同的国家或地区则可能存在不同的基因型的PEDV。自从1971年在英国出现PEDV以来，已经在猪中检测到具有各种遗传，抗原性和病理学特性的不同PEDV毒株。PEDV不断变异并且PEDV毒株之间经常发生重组，并且有时在PEDV和其他冠状病毒之间发生重组[1719]，这也是PED不断暴发的主要原因。
目前针对PEDV的商业疫苗接种方法仅部分有效。迄今为止，虽然抗病毒化合物先前已有报道，但尚未有针对PEDV感染的有效抗病毒药物[2021]。本次研究通过对已有的化学药物进行基于细胞水平的体外实验，以筛选出有效的针对PEDV的抗病毒药物，从而避免抗病毒药物的滥用，以期为PED的防制提供基础，有助于PED的全面防控，减少其带来的经济损失。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细胞与毒株
非洲绿猴肾细胞（Vero）由江苏省农业科学院兽医研究所提供，PEDV JS2008 株由江苏省农业科学院兽医研究所分离保存。
1．1．2 主要仪器
CO2恒温细胞培养箱（美国热电公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；分光光度计（BioMate? 3S 分光光度计，上海天能有限公司）；PAGE 电泳仪、Western Blotting 转膜仪（BioRad公司）；凝胶成像系统（Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统，上海天能有限公司）；7500 型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；酶标仪（ELX800，美国BioTek）；倒置荧光显微镜（Olympus IX51）；Millipore 超纯水机；PCR仪（宝生物工程有限公司）；小型台式高速冷冻离心机（德国艾本德股份有限公司）；移液枪（德国艾本德股份有限公司）；数显旋转气浴恒温振荡器（上海精风仪器有限公司）；超低温冰箱（大连三洋冷链有限公司）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1细胞与毒株 2
1.1.2 主要仪器 2
1.1.3 主要试剂 3
1.1.4 主要试剂及其配制 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 配制药物浓度 3
1.2.2 细胞培养 3
1.2.3进行药物初步筛选 3
1.2.4 间接免疫荧光试验 4
1.2.5 TaqMan法荧光定量PCR检测 4
1.2.6 蛋白质印迹法 5
1.2.7 统计分析 5
2 结果与分析 5
2.1药物的细胞毒性分析 5
2.2药物初步筛选结果 5
2.3 间接免疫荧光试验结果 6
2.4 荧光定量PCR结果 7
2.5 蛋白印迹结果 9
3讨论 9
致谢 10
参考文献 11 抗猪流行性腹泻病毒药物的筛选研究
引言
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病。主要临床症状为呕吐、腹泻、食欲下降和脱水，PED具有传染速度快、传染方式多、发病速度快等特点。不同性别、日龄和品种的猪均可感染，野猪亦可感染，仔猪和育成猪的发病率通常为 100 %，母猪为 15 %～90 %，这给养猪业造成了很大经济损失[1]。本病的流行特点、临床症状和猪传染性胃肠炎十分相似，临床上很难区分。
1976年，PEDV首次在中国报道，20世纪80年代后该病在中国广泛传播，造成严重经济损失，并在亚洲蔓延[2]。在2010年末，中国报道了与经典菌株相比发病率增加的“变种”PEDV毒株，其引起PED的大规模暴发，并被认为是第一个流行毒株[3]。2013年4月，在美国首次发现高致病性PEDV，并迅速蔓延至31个州以及墨西哥和加拿大。PEDV流行毒株的基因组与我国毒株的同源性高达97%99%，造成的临床疫情与发病猪的死亡情况皆与我国类似，对美国的养猪生产同样造成了不可估量的损失[46]。近年来，PED的频繁爆发，使其成为世界范围的猪传染病，PEDV已成为国内外兽医领域关注的重要病原之一 [79]。
猪流行性腹泻病毒是尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科 (Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus) I群成员之一。I群冠状病毒家族还包括猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、人类冠状病毒229E (Human coronavirus 229E, HCoV229E)等[1011]。从发现PEDV以来，人们先后尝试用不同的方法将PEDV适应细胞，均没有取得成功。直到1988年，Hofmann 等在培养基中加入胰酶首次使 PEDV成功的在Vero 细胞上繁殖。目前主要利用Vero传代细胞分离培养PEDV，也有报道用PK和ST细胞培养本病毒[1213]。
PEDV是单股正链RNA病毒,核酸具有感染性。全基因组长度约28 kb, 基因组包含编码复制酶（Rep）、纤突糖蛋白（S）、基质蛋白（M）、囊膜蛋白（E）、核蛋白（N）和ORF3等六个基因。其中复制酶是与蛋白复制有关的多聚蛋白。S蛋白是位于PEDV粒子表面的纤突蛋白，在病毒的侵入中发挥关键作用，且本病毒核酸的高变区主要在S基因上，因此S基因不仅在疫苗的设计上具有重要参考价值，而且也是分析毒株变异的参考基因。ORF3蛋白与病毒毒力调控病毒的复制。N蛋白是病毒的核衣壳蛋白，与基因组RNA相互缠绕形成螺旋的核衣壳，并具有高度保守性。猪在感染PEDV的早期体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体，所以N蛋白的存在对于本病诊断具有重要意义。M基因在病毒的组装和出芽过程中起重要作用，同时介导机体产生中和抗体[14]。作为RNA病毒，PEDV在选择压力作用下容易发生突变，且可能导致新的变异株的频繁出现[1516]。虽然PEDV只有一个血清型，但在不同的国家或地区则可能存在不同的基因型的PEDV。自从1971年在英国出现PEDV以来，已经在猪中检测到具有各种遗传，抗原性和病理学特性的不同PEDV毒株。PEDV不断变异并且PEDV毒株之间经常发生重组，并且有时在PEDV和其他冠状病毒之间发生重组[1719]，这也是PED不断暴发的主要原因。
目前针对PEDV的商业疫苗接种方法仅部分有效。迄今为止，虽然抗病毒化合物先前已有报道，但尚未有针对PEDV感染的有效抗病毒药物[2021]。本次研究通过对已有的化学药物进行基于细胞水平的体外实验，以筛选出有效的针对PEDV的抗病毒药物，从而避免抗病毒药物的滥用，以期为PED的防制提供基础，有助于PED的全面防控，减少其带来的经济损失。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细胞与毒株
非洲绿猴肾细胞（Vero）由江苏省农业科学院兽医研究所提供，PEDV JS2008 株由江苏省农业科学院兽医研究所分离保存。
1．1．2 主要仪器
CO2恒温细胞培养箱（美国热电公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；分光光度计（BioMate? 3S 分光光度计，上海天能有限公司）；PAGE 电泳仪、Western Blotting 转膜仪（BioRad公司）；凝胶成像系统（Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统，上海天能有限公司）；7500 型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；酶标仪（ELX800，美国BioTek）；倒置荧光显微镜（Olympus IX51）；Millipore 超纯水机；PCR仪（宝生物工程有限公司）；小型台式高速冷冻离心机（德国艾本德股份有限公司）；移液枪（德国艾本德股份有限公司）；数显旋转气浴恒温振荡器（上海精风仪器有限公司）；超低温冰箱（大连三洋冷链有限公司）。
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