哺乳动物皮质颗粒动态运转的机制研究
1多精受精是指超过一个精子进入卵子形成多个原核的异常受精形式，最终会导致早期胚胎死亡、流产和遗传性疾病。卵子防止多精受精的机制主要与一种被称为皮质颗粒的特殊细胞器有关，它是存在于未受精卵母细胞皮质区的一层分泌囊泡。受精后，皮质颗粒释放其内容物至卵周隙（透明带与卵细胞或受精卵细胞膜之间的空隙）、修饰细胞外基质以阻止多精受精。目前，有关皮质颗粒成分和功能的认识主要来自于海胆等无脊椎动物，而我们对哺乳动物的皮质颗粒知之甚少。最近，在小鼠中Ovastacin首次被鉴定为哺乳动物的皮质颗粒成分，负责受精后切割卵透明带中的精子受体ZP2来防止多精受精。本论文利用Ovastacin作为皮质颗粒的标识物，通过Ovastacin-mCherry转基因小鼠模型，应用分子生物学和细胞生物学等手段来探索皮质颗粒在卵子成熟和受精前的转运及调控机制，为阐明皮质颗粒转运和释放异常导致受精失败和引起多精受精的根本原因，全面了解哺乳动物皮质颗粒在生殖医学和家畜家禽繁殖学中的意义提供研究基础。
目录
引言
引言：目前，关于皮质颗粒的研究主要来自于海胆等无脊椎动物[1]，对哺乳动物皮质颗粒的成分和功能了解很少，唯一能确定的其生物学功能就是对受精后卵透明带的修饰，主要是对精子受体ZP2（ZonaPellucida 2）的切割，即所谓的皮质反应[2]。直到最近，美国国立卫生院Dean实验室才首次揭示了皮质反应的分子机制，发现了存在于皮质颗粒中负责切割ZP2的金属蛋白酶Ovastacin[3]。Ovastacin是一个卵巢特异表达的蛋白，定位在未受精卵母细胞的皮质区，受精后从皮质区消失，与公认的皮质颗粒分子探针LCA（Lens Culinaris Agglutinin）共定位。在正常小鼠的卵子中，精子与其透明带结合，启动受精；一旦受精，皮质反应也随即启动，透明带中ZP2的N端序列（精子结合位点）被皮质颗粒中的Ovastacin切割，从而不再支持精子结合，预防多精受精。然而在Ovastacin敲除小鼠中，卵子在受精之后，虽然皮质颗粒也释放了，但其透明带仍然能支持精子的结合，并且免疫印迹结果显示ZP2在胚胎外的透明带中没有被切割，说明Ovastacin就是生殖生物学家们寻找了30多年的存在于皮质颗粒中负责修饰卵透明带（切割ZP2）以防止多精受精的蛋白酶[3]。因此，皮质颗粒 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
在卵子皮质区的正确定位以及在特定时间点的排放对于成功受精和预防多精受精都很关键。如果皮质颗粒在卵子受精前就已经提前释放，或者是Ovastacin没有进入皮质颗粒而提前分泌出细胞外基质，卵透明带中的精子受体ZP2就会在受精前被切割，不能与精子结合，导致受精失败；相反，如果皮质颗粒在转运过程中出现问题，不能正确定位在卵子的皮质区，那么受精后就无法发生皮质反应，则导致多精受精。
虽然多年来生殖生物学家们早已认识皮质颗粒在受精过程中的重要作用，但是鉴于取材困难，并且缺乏分子标识物，哺乳动物皮质颗粒的相关研究一直停滞不前。确定Ovastacin是皮质颗粒中负责修饰卵透明带的成分不仅完善了对受精机理的认识，更重要的是它能作为分子标识物来探索皮质颗粒在受精以及其他生殖发育过程中的更多功能。因此，本项目将利用OvastacinmCherry转基因小鼠模型来研究皮质颗粒在小鼠卵母细胞成熟和受精过程中的动态转运及调控机制，为进一步阐明皮质颗粒转运和释放异常导致受精失败的分子机理，以及揭示多精受精的起因、提高体外受精的成功率、优化人类辅助生殖技术以及改善家畜家禽的遗传育种工作提供理论基础。
1.材料与方法
1.1材料选取与运用技术
材料选取：38周OvastacinmCherry转基因小鼠的GV期卵母细胞
运用技术：激光共聚焦显微镜技术、Time lapse成像技术、FRAP技术
1.2研究方法
本论文的总体思路就是利用哺乳动物卵母细胞中第一个被鉴定出来的皮质颗粒成分Ovastacin作为标识物，通过转基因小鼠来追踪和记录皮质颗粒在卵母细胞成熟和受精前的形成、分布、转运等过程，揭示皮质颗粒转运和释放异常与受精失败和多精受精之间的关系。为此，我们将从以下几个方面来展开研究：
① 利用微丝（Microfilament）和微管（Microtubule）的解聚剂，以及微丝成核因子（Actin nucleator）和微管动力蛋白（Microtubule motor protein）的抑制剂处理GV期的OvastacinmCherry卵母细胞，观察卵母细胞成熟过程中mCherry从胞质向皮质区的转运，确定细胞骨架对皮质颗粒迁移的影响；
② 采用荧光漂白恢复术（FRAP, Fluorescence Recovery After Photobleaching）淬灭OvastacinmCherry在皮质区的荧光信号，实时记录信号的恢复情况，确定皮质颗粒在皮质区的定位是否是动态变化的。如果是动态的，则利用微丝、微管解聚剂，以及脂类运动抑制剂确认影响其动态定位的因素；
③ 利用细胞骨架解聚剂研究无皮质颗粒区的形成机制。制作UtrCHGFP mRNA并显微注射至OvastacinmCherry的 MII卵子中，经过微丝成核因子Arp2/3复合物的抑制剂处理后，观察染色体迁移，微丝帽（Actin cap）消失与无皮质颗粒区消失的关系。
1.3研究步骤
1.3.1观察细胞骨架对皮质颗粒迁移的影响
将34周OvastacinmCherry转基因小鼠的GV期卵母细胞（直径大约60um）在分别含有微丝解聚剂Cytochalasin D（5ug/ml），微管解聚剂Nocodazole（10uM），微丝成核因子Arp2/3复合物抑制剂CK666（50uM），微丝成核因子Formin抑制剂SMIFH2（25uM），微管动力蛋白Kinesin抑制剂Monastrol（50uM），以及微管动力蛋白Dynein抑制剂Ciliobrevin D（50uM）的M16培养液中进行培养观察。Time lapse成像通过配有Plan Apochromat X 40/1.2 NA水浸物镜的Zeiss LSM 510 META共聚焦显微镜来完成，mCherry使用561nm激光激发，图像通过软件Time Series Control功能来获取（扫描10层，层隔：5um；时间间隔：10分钟；总时间：3小时）。
1.3.2观察皮质颗粒的动态定位及影响因素
将68周OvastacinmCherry转基因小鼠的卵母细胞，在分别含有微丝解聚剂Cytochalasin D（5ug/ml），微管解聚剂Nocodazole（10uM），以及脂类运动抑制剂Methylβcyclodextrin（10mM）的M16培养液中进行FRAP实验。FRAP实验通过Zeiss LSM 510 META的Bleach Control功能来完成（ 561nm激光强度：40%；重复次数：10）。在选取区域的mCherry荧光被漂白后，利用Time Series Control功能来获取图像观察荧光的恢复（扫描1层；时间间隔：1分钟；总时间：1小时）。
1.3.3观察无皮质颗粒形成与微丝帽的关系
从Addgene公司购买pCS2+UtrCHGFP质粒，线性化后采用SP6 mMESSAGE mMACHINE试剂盒（Ambion）体外转录成mRNA，经过MEGAclear试剂盒（Ambion）纯化后溶于20ul无RNA酶水中（1ug/ul）。显微注射510pl的UtrCHGFP mRNA至OvastacinmCherry的MII卵子中，将注射后的卵子置于M16培养液中继续培养6小时，让mRNA充分翻译成蛋白。之后将卵子转移至含有50uM CK666的M16培养液中，在激光共聚焦显微镜下，利用Time Series Control功能来获取图像（扫描10层，层隔：5um；时间间隔：5分钟；总时间：3小时），观察和记录染色体迁移，微丝帽聚集以及无皮质颗粒区形成与消失之间的动态变化关。Hoechst 33342（10ng/ml）加入培养液中用于染色体染色。
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引言
引言：目前，关于皮质颗粒的研究主要来自于海胆等无脊椎动物[1]，对哺乳动物皮质颗粒的成分和功能了解很少，唯一能确定的其生物学功能就是对受精后卵透明带的修饰，主要是对精子受体ZP2（ZonaPellucida 2）的切割，即所谓的皮质反应[2]。直到最近，美国国立卫生院Dean实验室才首次揭示了皮质反应的分子机制，发现了存在于皮质颗粒中负责切割ZP2的金属蛋白酶Ovastacin[3]。Ovastacin是一个卵巢特异表达的蛋白，定位在未受精卵母细胞的皮质区，受精后从皮质区消失，与公认的皮质颗粒分子探针LCA（Lens Culinaris Agglutinin）共定位。在正常小鼠的卵子中，精子与其透明带结合，启动受精；一旦受精，皮质反应也随即启动，透明带中ZP2的N端序列（精子结合位点）被皮质颗粒中的Ovastacin切割，从而不再支持精子结合，预防多精受精。然而在Ovastacin敲除小鼠中，卵子在受精之后，虽然皮质颗粒也释放了，但其透明带仍然能支持精子的结合，并且免疫印迹结果显示ZP2在胚胎外的透明带中没有被切割，说明Ovastacin就是生殖生物学家们寻找了30多年的存在于皮质颗粒中负责修饰卵透明带（切割ZP2）以防止多精受精的蛋白酶[3]。因此，皮质颗粒 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
在卵子皮质区的正确定位以及在特定时间点的排放对于成功受精和预防多精受精都很关键。如果皮质颗粒在卵子受精前就已经提前释放，或者是Ovastacin没有进入皮质颗粒而提前分泌出细胞外基质，卵透明带中的精子受体ZP2就会在受精前被切割，不能与精子结合，导致受精失败；相反，如果皮质颗粒在转运过程中出现问题，不能正确定位在卵子的皮质区，那么受精后就无法发生皮质反应，则导致多精受精。
虽然多年来生殖生物学家们早已认识皮质颗粒在受精过程中的重要作用，但是鉴于取材困难，并且缺乏分子标识物，哺乳动物皮质颗粒的相关研究一直停滞不前。确定Ovastacin是皮质颗粒中负责修饰卵透明带的成分不仅完善了对受精机理的认识，更重要的是它能作为分子标识物来探索皮质颗粒在受精以及其他生殖发育过程中的更多功能。因此，本项目将利用OvastacinmCherry转基因小鼠模型来研究皮质颗粒在小鼠卵母细胞成熟和受精过程中的动态转运及调控机制，为进一步阐明皮质颗粒转运和释放异常导致受精失败的分子机理，以及揭示多精受精的起因、提高体外受精的成功率、优化人类辅助生殖技术以及改善家畜家禽的遗传育种工作提供理论基础。
1.材料与方法
1.1材料选取与运用技术
材料选取：38周OvastacinmCherry转基因小鼠的GV期卵母细胞
运用技术：激光共聚焦显微镜技术、Time lapse成像技术、FRAP技术
1.2研究方法
本论文的总体思路就是利用哺乳动物卵母细胞中第一个被鉴定出来的皮质颗粒成分Ovastacin作为标识物，通过转基因小鼠来追踪和记录皮质颗粒在卵母细胞成熟和受精前的形成、分布、转运等过程，揭示皮质颗粒转运和释放异常与受精失败和多精受精之间的关系。为此，我们将从以下几个方面来展开研究：
① 利用微丝（Microfilament）和微管（Microtubule）的解聚剂，以及微丝成核因子（Actin nucleator）和微管动力蛋白（Microtubule motor protein）的抑制剂处理GV期的OvastacinmCherry卵母细胞，观察卵母细胞成熟过程中mCherry从胞质向皮质区的转运，确定细胞骨架对皮质颗粒迁移的影响；
② 采用荧光漂白恢复术（FRAP, Fluorescence Recovery After Photobleaching）淬灭OvastacinmCherry在皮质区的荧光信号，实时记录信号的恢复情况，确定皮质颗粒在皮质区的定位是否是动态变化的。如果是动态的，则利用微丝、微管解聚剂，以及脂类运动抑制剂确认影响其动态定位的因素；
③ 利用细胞骨架解聚剂研究无皮质颗粒区的形成机制。制作UtrCHGFP mRNA并显微注射至OvastacinmCherry的 MII卵子中，经过微丝成核因子Arp2/3复合物的抑制剂处理后，观察染色体迁移，微丝帽（Actin cap）消失与无皮质颗粒区消失的关系。
1.3研究步骤
1.3.1观察细胞骨架对皮质颗粒迁移的影响
将34周OvastacinmCherry转基因小鼠的GV期卵母细胞（直径大约60um）在分别含有微丝解聚剂Cytochalasin D（5ug/ml），微管解聚剂Nocodazole（10uM），微丝成核因子Arp2/3复合物抑制剂CK666（50uM），微丝成核因子Formin抑制剂SMIFH2（25uM），微管动力蛋白Kinesin抑制剂Monastrol（50uM），以及微管动力蛋白Dynein抑制剂Ciliobrevin D（50uM）的M16培养液中进行培养观察。Time lapse成像通过配有Plan Apochromat X 40/1.2 NA水浸物镜的Zeiss LSM 510 META共聚焦显微镜来完成，mCherry使用561nm激光激发，图像通过软件Time Series Control功能来获取（扫描10层，层隔：5um；时间间隔：10分钟；总时间：3小时）。
1.3.2观察皮质颗粒的动态定位及影响因素
将68周OvastacinmCherry转基因小鼠的卵母细胞，在分别含有微丝解聚剂Cytochalasin D（5ug/ml），微管解聚剂Nocodazole（10uM），以及脂类运动抑制剂Methylβcyclodextrin（10mM）的M16培养液中进行FRAP实验。FRAP实验通过Zeiss LSM 510 META的Bleach Control功能来完成（ 561nm激光强度：40%；重复次数：10）。在选取区域的mCherry荧光被漂白后，利用Time Series Control功能来获取图像观察荧光的恢复（扫描1层；时间间隔：1分钟；总时间：1小时）。
1.3.3观察无皮质颗粒形成与微丝帽的关系
从Addgene公司购买pCS2+UtrCHGFP质粒，线性化后采用SP6 mMESSAGE mMACHINE试剂盒（Ambion）体外转录成mRNA，经过MEGAclear试剂盒（Ambion）纯化后溶于20ul无RNA酶水中（1ug/ul）。显微注射510pl的UtrCHGFP mRNA至OvastacinmCherry的MII卵子中，将注射后的卵子置于M16培养液中继续培养6小时，让mRNA充分翻译成蛋白。之后将卵子转移至含有50uM CK666的M16培养液中，在激光共聚焦显微镜下，利用Time Series Control功能来获取图像（扫描10层，层隔：5um；时间间隔：5分钟；总时间：3小时），观察和记录染色体迁移，微丝帽聚集以及无皮质颗粒区形成与消失之间的动态变化关。Hoechst 33342（10ng/ml）加入培养液中用于染色体染色。
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