鹅星状病毒对鹅胚致病性研究
从安徽滁州的养殖场寄来的死亡小鹅中分离鉴定出一种星状病毒。经过相互比较和系统发育分析表明，这是一组新的鹅星状病毒，与之前已经被报道的星状病毒属中的星状病毒不一样。本实验对从病死鹅脏器中分离到的病毒致病性进行初步研究，为未来对其做进一步研究打下奠基石。取病死鹅的肾脏、肝脏、脾脏、胰腺组织冻融3次后充分匀浆,12000g/min离心4分钟取上清液,通过卵黄囊接种方式接种10日龄鹅胚,从24-120h死亡的鹅胚尿囊液中提取病毒的RNA。根据禽星状病毒基因的保守序列ORF1b设计特异性引物,利用该引物对所提取的病毒RNA进行RT-PCR检测鉴定。同时剖检鹅胚，观察接种病毒的鹅胚脏器病理学变化，与阴性对照胚进行比较，取病变脏器做病理学切片观察病理学变化和提取RNA做RT-PCR鉴定。结果证实该病毒能够致死鹅胚，在尿囊液、肾脏脾脏组织中均检测到病毒存在，主要造成鹅胚严重的皮下水肿，内脏淤血，肾脏肿大和明显的尿酸盐沉积，组织学检查观察到肾小管坏死和异嗜性细胞存在，表明肾脏组织已被破坏且有严重的炎症反应，证实该病毒对肾脏损伤巨大，同时也会造成脾脏病变。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 试验材料3
1.1.1 病料3
1.1.2 动物3
1.1.3 试剂3
1.2 引物设计与合成3
1.3 试验方法3
1.3.1 病毒的分离3
1.3.2 鹅胚攻毒3
1.3.3 鹅胚剖检3
1.3.4 RTPCR鉴定4
2 结果与分析5
2.1 临床表现及剖检观察结果5
2.2 RTPCR检测结果5
2.3 鹅胚攻毒结果5
3 讨论8
3.1 前期工作8
3.2 病毒的分离与鉴定8
3.3 RTPCR的关键步骤8
3.4 本实验的不足之处8
结论9
致谢9
参考文献10
鹅星状病毒对鹅胚致病性研究
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
/> 引言
星状病毒（Astrovirus,AstV）是1975年由Appleton和Higgins利用电镜从腹泻儿童粪便标本中发现的。病毒颗粒有明显纤突，负染后经电镜观察大概有10%的病毒颗粒表现为五角或六角星形状，因此而得名。星状病毒科包括感染哺乳动物的哺乳类星状病毒（Mamastrovirus）和感染禽类的禽星状病毒（Avastrovirus，AAstV）两个属。根据其宿主的不同，各病毒属又分为不同的病毒种，如禽星状病毒属的火鸡星状病毒，鸭星状病毒等[1]。星状病毒基因组为单分子线状正链RNA，大小为6800nt，5’端与VPg蛋白共价结合，3’端为聚A尾。RNA有感染性。两个主要衣壳蛋白的分子质量分别为90000u及2700030000u，还有一些次要蛋白及非结构蛋白。病毒在复制过程中产生全长基因组RNA及24000nt的亚基因组RNA，后者编码主要的衣壳蛋白的前体[2]。本实验中研究的鹅星状病毒（GastV）属于禽星状病毒属，禽星状病毒基因组长度为6.4至7.7 kb，由三个开放阅读框（ORF 1a，1b和2）、5’非翻译区（UTR）和3’UTR组成，后面跟着多聚腺苷酸尾巴[3]。ORF1a编码丝氨酸蛋白酶，跨膜螺旋和核定位信号，ORF1b编码RNA依赖性RNA聚合酶， ORF2编码病毒体形成所需的衣壳蛋白。ORF1b被认为是AAstV基因组中最保守的部分，也是 AAstV和哺乳动物星状病毒中最保守的部分。除了ORF2的N末端高度保守的415个氨基酸之外，ORF2似乎是星状病毒基因组中最可变的部分[4]。
根据国际病毒分类委员会的规定，目前有三种不同的星状病毒属属于禽星状病毒属，即Avastrovirus 1,2和3，分别感染火鸡、鸡和鸭[5]。AstV感染已被证实与多种疾病有关，例如鸡传染性胃肠炎和死亡综合征，肉鸡发育迟缓综合征，白色小鸡孵化病，肉鸡肾脏和内脏痛风和雏鸭致死性肝炎，主要组织分布是肠道、脾脏、肾脏和肝脏[5]。越来越多的证据表明，家禽之间星状病毒感染存在高度的交叉物种传播，甚至可能感染人类。相比之下，国内关于鹅群的AstV感染病例较少见[6]。Bidin等人做了克罗地亚鹅群感染禽肾炎病毒的检测报道[7]，并提供证据表明这种AstV与鹅胚胎的发育迟缓和孵化前死亡率有关。从鹅的临床样本中检测出AstV基因组的研究表明，这些病毒可能广泛分布于其他家禽群如这之中看到的鹅群[3][4]。近几次关于鹅星状病毒的报道，发现有些病鹅感染后无法移动和无法正常栖息，没有发现典型的尸检和特定病变[8]，也有些病鹅表现出肠炎症状[3]，还有病鹅显示精神沉郁，独坐，眼睑部表现出明显的灰白色浑浊外观[6],死亡率较高，给鹅场造成了巨大的经济损失。临床病鹅剖检发现心脏，肝脏和肾脏浆液表面有尿酸盐沉积，还观察到具有丰富尿酸盐颗粒的胆囊扩张[6]。
本实验从安徽滁州寄来的突发死亡的病鹅中分离到一组星状病毒，两两比较和系统发育分析表明，这是一组新的鹅星状病毒，与先前已知的星状病毒属中的星状病毒不同[6]。为了解此病毒致病性，将其接种到鹅胚上培育，收取尿囊液、脏器提取RNA做RTPCR检测，并观察其对鹅胚造成的病理学变化，为开展该病毒的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 病料
病料样品为2017年12月来自安徽滁州某鹅场寄来的4日龄死亡小鹅，采取肾脏，脾脏，肝脏，胰腺作为样品。
1．1．2 动物
13日龄普通鹅胚。
1．1．3 试剂
GeneJET Viral DNA and RNA Purification Kit购自Thermo Scientific公司；HiScript?QRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)来自于Vazyme公司；GoTap?Green Master Mix来自于Promega公司；TanonTM 5000 DNA Marker购自Tanon公司。
1．2 引物设计与合成
根据禽星状病毒基因组最保守序列ORF1b阅读框设计一对特异性检测引物：上游5’CGCTTYGATGGNACNATFCC3’，下游5’AARCCNTACACCCAKTTYGG3’，送公司合成。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 试验材料3
1.1.1 病料3
1.1.2 动物3
1.1.3 试剂3
1.2 引物设计与合成3
1.3 试验方法3
1.3.1 病毒的分离3
1.3.2 鹅胚攻毒3
1.3.3 鹅胚剖检3
1.3.4 RTPCR鉴定4
2 结果与分析5
2.1 临床表现及剖检观察结果5
2.2 RTPCR检测结果5
2.3 鹅胚攻毒结果5
3 讨论8
3.1 前期工作8
3.2 病毒的分离与鉴定8
3.3 RTPCR的关键步骤8
3.4 本实验的不足之处8
结论9
致谢9
参考文献10
鹅星状病毒对鹅胚致病性研究
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
/> 引言
星状病毒（Astrovirus,AstV）是1975年由Appleton和Higgins利用电镜从腹泻儿童粪便标本中发现的。病毒颗粒有明显纤突，负染后经电镜观察大概有10%的病毒颗粒表现为五角或六角星形状，因此而得名。星状病毒科包括感染哺乳动物的哺乳类星状病毒（Mamastrovirus）和感染禽类的禽星状病毒（Avastrovirus，AAstV）两个属。根据其宿主的不同，各病毒属又分为不同的病毒种，如禽星状病毒属的火鸡星状病毒，鸭星状病毒等[1]。星状病毒基因组为单分子线状正链RNA，大小为6800nt，5’端与VPg蛋白共价结合，3’端为聚A尾。RNA有感染性。两个主要衣壳蛋白的分子质量分别为90000u及2700030000u，还有一些次要蛋白及非结构蛋白。病毒在复制过程中产生全长基因组RNA及24000nt的亚基因组RNA，后者编码主要的衣壳蛋白的前体[2]。本实验中研究的鹅星状病毒（GastV）属于禽星状病毒属，禽星状病毒基因组长度为6.4至7.7 kb，由三个开放阅读框（ORF 1a，1b和2）、5’非翻译区（UTR）和3’UTR组成，后面跟着多聚腺苷酸尾巴[3]。ORF1a编码丝氨酸蛋白酶，跨膜螺旋和核定位信号，ORF1b编码RNA依赖性RNA聚合酶， ORF2编码病毒体形成所需的衣壳蛋白。ORF1b被认为是AAstV基因组中最保守的部分，也是 AAstV和哺乳动物星状病毒中最保守的部分。除了ORF2的N末端高度保守的415个氨基酸之外，ORF2似乎是星状病毒基因组中最可变的部分[4]。
根据国际病毒分类委员会的规定，目前有三种不同的星状病毒属属于禽星状病毒属，即Avastrovirus 1,2和3，分别感染火鸡、鸡和鸭[5]。AstV感染已被证实与多种疾病有关，例如鸡传染性胃肠炎和死亡综合征，肉鸡发育迟缓综合征，白色小鸡孵化病，肉鸡肾脏和内脏痛风和雏鸭致死性肝炎，主要组织分布是肠道、脾脏、肾脏和肝脏[5]。越来越多的证据表明，家禽之间星状病毒感染存在高度的交叉物种传播，甚至可能感染人类。相比之下，国内关于鹅群的AstV感染病例较少见[6]。Bidin等人做了克罗地亚鹅群感染禽肾炎病毒的检测报道[7]，并提供证据表明这种AstV与鹅胚胎的发育迟缓和孵化前死亡率有关。从鹅的临床样本中检测出AstV基因组的研究表明，这些病毒可能广泛分布于其他家禽群如这之中看到的鹅群[3][4]。近几次关于鹅星状病毒的报道，发现有些病鹅感染后无法移动和无法正常栖息，没有发现典型的尸检和特定病变[8]，也有些病鹅表现出肠炎症状[3]，还有病鹅显示精神沉郁，独坐，眼睑部表现出明显的灰白色浑浊外观[6],死亡率较高，给鹅场造成了巨大的经济损失。临床病鹅剖检发现心脏，肝脏和肾脏浆液表面有尿酸盐沉积，还观察到具有丰富尿酸盐颗粒的胆囊扩张[6]。
本实验从安徽滁州寄来的突发死亡的病鹅中分离到一组星状病毒，两两比较和系统发育分析表明，这是一组新的鹅星状病毒，与先前已知的星状病毒属中的星状病毒不同[6]。为了解此病毒致病性，将其接种到鹅胚上培育，收取尿囊液、脏器提取RNA做RTPCR检测，并观察其对鹅胚造成的病理学变化，为开展该病毒的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 病料
病料样品为2017年12月来自安徽滁州某鹅场寄来的4日龄死亡小鹅，采取肾脏，脾脏，肝脏，胰腺作为样品。
1．1．2 动物
13日龄普通鹅胚。
1．1．3 试剂
GeneJET Viral DNA and RNA Purification Kit购自Thermo Scientific公司；HiScript?QRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)来自于Vazyme公司；GoTap?Green Master Mix来自于Promega公司；TanonTM 5000 DNA Marker购自Tanon公司。
1．2 引物设计与合成
根据禽星状病毒基因组最保守序列ORF1b阅读框设计一对特异性检测引物：上游5’CGCTTYGATGGNACNATFCC3’，下游5’AARCCNTACACCCAKTTYGG3’，送公司合成。
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