日本血吸虫凝溶胶蛋白的克隆与表达
日本血吸虫病流行于中国、菲律宾、印度尼西亚等地,是一种人畜共患寄生虫病,严重危害人畜健康。筛选高效的疫苗候选分子、更加特异的诊断抗原以及新的药物靶点成为血吸虫病防控的需求，是控制血吸虫病流行, 消除其对人类健康危害的关键。由肠上皮和（或）表皮以及其他特异排泄分泌器官在整个生命周期释放或分泌的排泄分泌产物能引起宿主免疫调节反应。本文对日本血吸虫排泄分泌蛋白凝溶胶蛋白的编码基因进行克隆和表达，利用PCR技术扩增基因，获得了1122 bp的cDNA序列。构建了重组表达质粒pET-28a(+)-gelsolin，并在大肠杆菌中成功表达，重组蛋白分子量约43.5 kDa。为后续更深入地研究该蛋白的生物学功能奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 实验动物2
1.1.2 主要仪器设备2
1.1.3 主要材料与试剂 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 日本血吸虫42d虫体的收集 2
1.2.2 日本血吸虫42d cDNA模版的制备2
1.2.3 日本血吸虫凝溶胶基因的克隆3
1.2.4 日本血吸虫凝溶胶基因的生物信息学分析 5
1.2.5 重组质粒pET28a(+)gelsolin的构建与鉴定 5
1.2.6 重组蛋白的制备7
2 结果与分析 8
2.1 日本血吸虫凝溶胶基因的克隆8
2.1.1 凝溶胶基因PCR扩增8
2.1.2 重组T载体质粒菌液PCR鉴定8
2.2 凝溶胶基因的生物信息学分析9
2.3 重组质粒pET28a(+)gelsolin的构建及鉴定10
2.4 重组质粒pET28a(+)gelsolin在大肠杆菌中的表达及其表达时相分析10
2.4.1 pET28a(+)gelsolin的原核表达分析10
2.4.2 重组蛋白的表达时相分析11
2.4.3 重组蛋白的纯化11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
/> 2.4.4 重组蛋白的浓度测定12
3 讨论 12
致谢12
参考文献13
日本血吸虫凝溶胶蛋白的克隆与表达
引言
血吸虫病（Schistosomiasis）是由血吸虫的感染引起的一种人兽共患寄生虫病，其病变特征为肝脏肉芽肿和纤维化。血吸虫病为全球性疾病，尤其在中国地区、菲律宾地区、日本地区等发病率较高，对人类和动物的健康产生严重危害。根据统计，全世界每年约有50万人因感染了血吸虫病而死亡。在我国主要流行的是日本血吸虫病（Schistosomiasis japonicum），湖沼地区（长江流域、洞庭湖等）是血吸虫病高发地段[12]。为了更有效地防治血吸虫病，筛选高效的疫苗候选分子、更加特异的诊断抗原以及新的药物靶点，是控制血吸虫病流行的关键[34]。其中，由肠上皮和（或）表皮以及其他特异排泄分泌器官在整个生命周期释放或分泌的排泄分泌产物能引起宿主免疫调节反应[5]。这些排泄分泌蛋白直接表露于宿主免疫系统，诱导宿主的免疫应答，使宿主的免疫反应过程受到滋扰，进而使血吸虫避开宿主的免疫攻击。
血吸虫排泄分泌蛋白的重要功能及研究意义有：①排泄分泌蛋白在血吸虫生长发育中发挥了重要的作用，因为其含有一些重要的酶、信号传导蛋白和解毒分子等；②由于血吸虫排泄分泌蛋白的不断变化，其对血吸虫成功躲避宿主免疫攻击，能够在宿主体内存活和繁殖起重要作用；③一些已表现出良好的免疫保护效果的血吸虫疫苗候选分子，已证实在血吸虫排泄分泌产物中呈现；④由于排泄分泌蛋白暴露于宿主的免疫系统并引起宿主的免疫应答，一些排泄分泌蛋白已被证明是良好的血吸虫病诊断抗原。因此，对排泄分泌蛋白的研究有利于理解血吸虫调节寄主免疫应答、与寄主相互作用的机制。同时，这些信息有利于发现控制血吸虫病的疫苗候选分子、新的诊断试剂及新药物靶点[6]。
Angeli 等[7]报道曼氏血吸虫尾蚴的排泄分泌抗原能够在局部皮肤诱导IL1受体拮抗因子（ILIra）来抑制皮肤炎症反应；Jenkins等[8]报道曼氏血吸虫尾蚴中排泄分泌抗原可降低寄主免疫反应；除此之外，曼氏血吸虫虫卵和童虫[9]的排泄分泌蛋白组研究已有报道。Liao 等[10]应用生物信息学技术比较分析了日本血吸虫排泄、分泌蛋白和非排泄、分泌蛋白的序列，发现排泄、分泌蛋白含更多的免疫相关结合肽，更有可能参与宿主的免疫调节。
本实验室通过蛋白质组学技术对日本血吸虫排泄分泌蛋白进行了鉴定分析，从该鉴定结果中选择日本血吸虫凝溶胶蛋白（gelsolin），本研究重点对该蛋白的编码基因进行克隆和表达，为后续更深入地研究该蛋白的生物学功能奠定了一定的基础[1113]。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验动物 新西兰大白兔（雄性，2.5~3.0 kg，罗泾飞达上海实验动物养殖中心）
1．1．2 主要仪器设备 恒温水浴锅（DK8D，金坛市医疗仪器厂）；超净工作台、摇床培养箱（SKY2102C，上海苏坤公司）；恒温振荡器（THZC，太仓市实验设备厂）；T100? PCR仪（BioRad公司）；SDSPAGE蛋白电泳仪（BioRad公司）；离心机（5804R，Eppendorf公司）；分光光度计（Nanodrop2000，Thermo Scientific公司）；离心机（FRESCO17，Thermo Scientific公司）；高压灭菌锅（SX500，TOMY公司）；电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；电子天平（MP2002，上海舜宇恒平公司）；超声波细胞破碎仪（JY92II DN，上海净信实验设备科技部）；超纯水仪（Millipore公司）。
1．1．3 主要材料与试剂 质粒克隆载体pMD?19T（辽宁大连宝公司）；表达载体pET28a(+)（上海兽医研究所动物血吸虫病研究室）；大肠杆菌感受态细胞DH5α（上海前尘公司）大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)（上海前尘公司）；Trizol（Invitrogen公司）；superscripTM II反转录酶（Invitrogen公司）；AxyPrep 质粒DNA小量试剂盒（Axygen公司）；TaKaRa Ex Taq?、T4 DNA Ligase、pMDTM19T vector 、限制性内切酶BamH I 、Sac I、10x QuickCut Green Buffer（TaKaRa生物工程有限公司）；DEPC（上海升正公司）；IPTG（上海升正公司）；DNA Marker（北京康为世纪公司）；Taq MasteMix（北京康为世纪公司）；Protein Ruler? Ⅱ（北京全式金公司）；Protein Ladder（Thermo Scientific公司）；DNA快速纯化试剂盒（北京百泰克公司）；NiNTA His Bind? Resin（MerckNovagen，Novagen公司）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 实验动物2
1.1.2 主要仪器设备2
1.1.3 主要材料与试剂 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 日本血吸虫42d虫体的收集 2
1.2.2 日本血吸虫42d cDNA模版的制备2
1.2.3 日本血吸虫凝溶胶基因的克隆3
1.2.4 日本血吸虫凝溶胶基因的生物信息学分析 5
1.2.5 重组质粒pET28a(+)gelsolin的构建与鉴定 5
1.2.6 重组蛋白的制备7
2 结果与分析 8
2.1 日本血吸虫凝溶胶基因的克隆8
2.1.1 凝溶胶基因PCR扩增8
2.1.2 重组T载体质粒菌液PCR鉴定8
2.2 凝溶胶基因的生物信息学分析9
2.3 重组质粒pET28a(+)gelsolin的构建及鉴定10
2.4 重组质粒pET28a(+)gelsolin在大肠杆菌中的表达及其表达时相分析10
2.4.1 pET28a(+)gelsolin的原核表达分析10
2.4.2 重组蛋白的表达时相分析11
2.4.3 重组蛋白的纯化11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
/> 2.4.4 重组蛋白的浓度测定12
3 讨论 12
致谢12
参考文献13
日本血吸虫凝溶胶蛋白的克隆与表达
引言
血吸虫病（Schistosomiasis）是由血吸虫的感染引起的一种人兽共患寄生虫病，其病变特征为肝脏肉芽肿和纤维化。血吸虫病为全球性疾病，尤其在中国地区、菲律宾地区、日本地区等发病率较高，对人类和动物的健康产生严重危害。根据统计，全世界每年约有50万人因感染了血吸虫病而死亡。在我国主要流行的是日本血吸虫病（Schistosomiasis japonicum），湖沼地区（长江流域、洞庭湖等）是血吸虫病高发地段[12]。为了更有效地防治血吸虫病，筛选高效的疫苗候选分子、更加特异的诊断抗原以及新的药物靶点，是控制血吸虫病流行的关键[34]。其中，由肠上皮和（或）表皮以及其他特异排泄分泌器官在整个生命周期释放或分泌的排泄分泌产物能引起宿主免疫调节反应[5]。这些排泄分泌蛋白直接表露于宿主免疫系统，诱导宿主的免疫应答，使宿主的免疫反应过程受到滋扰，进而使血吸虫避开宿主的免疫攻击。
血吸虫排泄分泌蛋白的重要功能及研究意义有：①排泄分泌蛋白在血吸虫生长发育中发挥了重要的作用，因为其含有一些重要的酶、信号传导蛋白和解毒分子等；②由于血吸虫排泄分泌蛋白的不断变化，其对血吸虫成功躲避宿主免疫攻击，能够在宿主体内存活和繁殖起重要作用；③一些已表现出良好的免疫保护效果的血吸虫疫苗候选分子，已证实在血吸虫排泄分泌产物中呈现；④由于排泄分泌蛋白暴露于宿主的免疫系统并引起宿主的免疫应答，一些排泄分泌蛋白已被证明是良好的血吸虫病诊断抗原。因此，对排泄分泌蛋白的研究有利于理解血吸虫调节寄主免疫应答、与寄主相互作用的机制。同时，这些信息有利于发现控制血吸虫病的疫苗候选分子、新的诊断试剂及新药物靶点[6]。
Angeli 等[7]报道曼氏血吸虫尾蚴的排泄分泌抗原能够在局部皮肤诱导IL1受体拮抗因子（ILIra）来抑制皮肤炎症反应；Jenkins等[8]报道曼氏血吸虫尾蚴中排泄分泌抗原可降低寄主免疫反应；除此之外，曼氏血吸虫虫卵和童虫[9]的排泄分泌蛋白组研究已有报道。Liao 等[10]应用生物信息学技术比较分析了日本血吸虫排泄、分泌蛋白和非排泄、分泌蛋白的序列，发现排泄、分泌蛋白含更多的免疫相关结合肽，更有可能参与宿主的免疫调节。
本实验室通过蛋白质组学技术对日本血吸虫排泄分泌蛋白进行了鉴定分析，从该鉴定结果中选择日本血吸虫凝溶胶蛋白（gelsolin），本研究重点对该蛋白的编码基因进行克隆和表达，为后续更深入地研究该蛋白的生物学功能奠定了一定的基础[1113]。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验动物 新西兰大白兔（雄性，2.5~3.0 kg，罗泾飞达上海实验动物养殖中心）
1．1．2 主要仪器设备 恒温水浴锅（DK8D，金坛市医疗仪器厂）；超净工作台、摇床培养箱（SKY2102C，上海苏坤公司）；恒温振荡器（THZC，太仓市实验设备厂）；T100? PCR仪（BioRad公司）；SDSPAGE蛋白电泳仪（BioRad公司）；离心机（5804R，Eppendorf公司）；分光光度计（Nanodrop2000，Thermo Scientific公司）；离心机（FRESCO17，Thermo Scientific公司）；高压灭菌锅（SX500，TOMY公司）；电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；电子天平（MP2002，上海舜宇恒平公司）；超声波细胞破碎仪（JY92II DN，上海净信实验设备科技部）；超纯水仪（Millipore公司）。
1．1．3 主要材料与试剂 质粒克隆载体pMD?19T（辽宁大连宝公司）；表达载体pET28a(+)（上海兽医研究所动物血吸虫病研究室）；大肠杆菌感受态细胞DH5α（上海前尘公司）大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)（上海前尘公司）；Trizol（Invitrogen公司）；superscripTM II反转录酶（Invitrogen公司）；AxyPrep 质粒DNA小量试剂盒（Axygen公司）；TaKaRa Ex Taq?、T4 DNA Ligase、pMDTM19T vector 、限制性内切酶BamH I 、Sac I、10x QuickCut Green Buffer（TaKaRa生物工程有限公司）；DEPC（上海升正公司）；IPTG（上海升正公司）；DNA Marker（北京康为世纪公司）；Taq MasteMix（北京康为世纪公司）；Protein Ruler? Ⅱ（北京全式金公司）；Protein Ladder（Thermo Scientific公司）；DNA快速纯化试剂盒（北京百泰克公司）；NiNTA His Bind? Resin（MerckNovagen，Novagen公司）。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/833.html
